新型AMPA受体调节剂抗呼吸抑制作用及机制研究.doc

新型AMPA受体调节剂抗呼吸抑制作用及机制研究镇静、镇痛和麻醉类药物（如吗啡、芬太尼、丙泊酚等）是临床常用药物,广泛用于急慢性疼痛治疗、辅助诱导麻醉和静脉复合麻醉等。该类药物发挥效应时均不可避免的产生呼吸抑制而成为致死的重要原因。目前用于急救镇静、镇痛和麻醉类药物所致呼吸抑制的首选治疗药是相应靶点的拮抗剂（如纳洛酮、氟马西尼等）。但拮抗时普遍存在给药方式单一、持续时间短、剂量不可控、需长时间密切观察等缺点,更重要的是拮抗剂是靶向治疗药物,在未明确致呼吸抑制药（毒）物类型时,无法第一时间选择相应拮抗剂进行治疗,从而错过急救时机。呼吸兴奋剂（尼可刹米、洛贝林等）是非特异性抗呼吸抑制剂,但该类药物存在安全范围窄、作用时间短、不良反应多等弊端。因此,研制呼吸抑制的非特异性对症治疗药物对镇静、镇痛和麻醉类药物的安全使用,提升临床急救能力具有重要意义。近几年众多文献报道调节AMPA受体可调控呼吸功能,AMPA受体在延髓呼吸中枢的前包钦格复合体广泛分布,对呼吸节律的形成和呼吸冲动的传导发挥着关键作用;且已证实以Ampakine为代表的AMPA受体调节剂可以对抗多种药（毒）物所致的呼吸抑制。AMPA受体调节剂潜在的镇痛效应,改善学习记忆,神经保护等作用可以使救治预后更好,因此AMPA受体调节剂有望成为非特异性抗呼吸抑制药物,其广谱作用特性与拮抗剂或呼吸兴奋剂相比具有显著优势。基于此,本所药物化学研究室合成了一系列全新结构AMPA受体正向调节剂,本室经过抗呼吸抑制药效学筛选,已初步证实LCX001具有抗呼吸抑制作用和镇痛效应。为了进一步明确LCX001抗呼吸抑制作用是否具有广谱性,本研究采用阿片类、中枢抑制剂和麻醉药致呼吸抑制的动物模型,采用整体动物肺功能检测方法观察LCX001抗呼吸抑制作用的广谱性和非特异性作用特点。其次,为了解决LCX001水溶性较差及血脑屏障透过率低的问题,基于LCX001化学结构,进行脑靶向前药化改造以提升血脑屏障透过率和中枢分布,并对所得化合物进行了初步的抗呼吸抑制效应的筛选和药效评价,以期获得更为强效和安全的AMPA受体正向调节剂。最后,鉴于AMPA受体的膜定位程度和通道开放状态决定了AMPA受体的功能强弱,而这两个关键过程都受到转运蛋白的调控,我们利用电生理和细胞成像等技术测定了LCX001对转运调控蛋白stargazin表达的影响,观察其导致AMPA受体（不同亚基）的膜定位程度的变化,并进一步考察该变化对AMPA通道的开放状态产生的影响,最终导致的神经元Ca²⁺内流和细胞整体功能的变化来解释LCX001正向调节AMPA受体功能的作用特点和抗呼吸抑制的作用机制。研究目的:确证新型化合物LCX001抗呼吸抑制的作用特点和正向调节作用机制。研究方法:1.LCX001抗呼吸抑制广谱性评价:采用清醒无创全身体积描记法记录LCX001对阿片类（芬太尼、TH-030418）、丙泊酚和戊巴比妥等致呼吸抑制大鼠肺功能参数（呼吸频率、通气量）的影响。2.LCX001脑靶向前药抗呼吸抑制药效筛选和评价:选择强效阿片激动剂TH-030418建立小鼠急性致死模型,筛选出可显著提高小鼠存活率的LCX001脑靶向前药化合物,通过考察候选化合物对阿片致模型小鼠急性毒性LD₅₀剂量的影响、对改善模型大鼠呼吸抑制效应的时效量效研究、对动脉血氧饱和度、二氧化碳分压、pH的影响等方法综合评价候选化合物改善呼吸抑制的效应,并与LCX001进行比较研究。3.LCX001对AMPA受体转运和突触定位的作用:3.1蛋白免疫印迹实验考察LCX001处理对AMPA转运调控蛋白stargazin蛋白表达的影响。3.2用细胞免疫荧光直接观察和活细胞成像技术动态观察LCX001引发pH敏感性荧光蛋白标记的AMPA受体在细胞膜表面分布定位的变化,考察LCX001上调转运调控蛋白stargazin对AMPA受体转运定位的影响;4.LCX001对AMPA离子通道开放特性和细胞兴奋性的作用:采用膜片钳全细胞记录的方式研究LCX001对谷氨酸激活AMPA-GluA2（R）离子通道电流幅值、失敏常数等多项指标的作用,考察化合物对离子通道开放程度,电流的衰减快慢的影响,明确化合物是否具有促激动活性及正性调节能力。5.LCX001对神经元钙内流的调节作用:利用钙成像检测LCX001稳定GluA2亚基神经元膜表面的定位对神经元钙内流产生的效应;研究结果:1.LCX001抗呼吸抑制具有广谱性LCX001有效改善阿片、丙泊酚和戊巴比妥所致的呼吸抑制:静脉给予芬太尼（120μg/kg）和TH-030418（20μg/kg）均导致严重的呼吸抑制,呼吸频率（BPM）下降70-80%,通气量（MV）下降50%;腹腔给予戊巴比妥（80mg/kg）使BPM与