新型光敏抗肿瘤活性物质的发现及作用机理研究.doc

新型光敏抗肿瘤活性物质的发现及作用机理研究光动力疗法(Photodynamictherapy,PDT)及光敏活性物质的抗肿瘤作用,具有能够定向杀伤肿瘤组织,且与其他疗法协同的优点。然而,尽管目前有不少光敏的药物已经应用于临床,但仍存在暗毒性大的缺点。因此,积极寻找新型的低毒高效的活性物质,开发出新型光敏药物,已经成为抗肿瘤药物研究的重点之一。羰非那烯-2,3-二腈骨架具有良好的光谱特性,然而却由于其毒副作用强的缺点,暂时还未有上市药物,对羰非那烯类衍生物解毒增效的研究,对于提高光敏抗肿瘤药物的疗效具有十分重要的意义。在前期的研究过程中,一系列具有较好体外单线态氧产率的羰非那烯类衍生物引起了肿瘤治疗学领域的关注。为此,本课题旨在通过光敏活性化合物抗肿瘤筛选模型的建立,拟筛选和发现具有活性好、毒副作用低特点的新型光敏活性化合物,为进一步开发新型光敏抗肿瘤药物打下基础。本课题在研究过程中发现,作为羰非那烯-2,3-二腈的衍生物3B,针对肿瘤细胞显示出显著的光敏活性和较低的暗毒性,研究表明该化合物具有较好的抗肿瘤活性。为此,本课题进一步从肿瘤分子药理学水平研究了化合物3B的作用机制以及分子靶点。本研究通过体外MTT细胞毒性实验,测定了该化合物3B对于近10种不同种细胞株增殖活性的影响。结果显示,该化合物3B对于MCF7乳腺癌细胞株作用最为显著(IC50=19.8±1.2μM),同时对于人正常细胞的毒性(IC50>50μM)较小,从而显示出非常好的研发前景。其次,使用激光共聚焦显微镜进行亚细胞定位实验后发现,新型光敏活性化合物3B能够优先定位于细胞的线粒体。通过Hoechst染色实验,流式细胞分析等实验发现了光动力处理后能够诱导肿瘤细胞的线粒体凋亡。通过检验线粒体凋亡通路蛋白及基因的含量变化,确定了新型光敏活性化合物3B通过调节线粒体凋亡途径从而诱导乳腺癌MCF7细胞凋亡的机制。光敏剂的特点是产生ROS,从而杀伤肿瘤细胞。本实验结果显示,新型光敏活性化合物3B能够通过增加细胞内ROS的含量,从而抑制细胞的糖酵解的能力,降低炎症因子及炎症相关通路的表达,进而影响Warburg效应。Warburg效应在肿瘤代谢中起到了非常重要的作用,是区别肿瘤细胞与正常细胞获得能量的方式。Warburg效应调控与miRNA相关,miRNA作为新发现的非编码小RNA分子,能够通过对靶基因的调控,参与生物学功能。因此,结合肿瘤代谢及miRNA,进而影响肿瘤的发展过程,成为了肿瘤治疗新的研究方向。实验结果显示,新型光敏活性化合物3B能够抑制miR-155-5p的表达,同时靶向作用于JAK/STAT通路下游蛋白SOCSl。另一方面,调节miR-155-5p的含量具有影响糖酵解,炎症相关因子及炎症通路的作用,进而影响肿瘤细胞的增殖,证明了Warburg效应调控与miRNA之间的相关性。同时,新型光敏活性化合物3B在小鼠体内也具有良好的肿瘤抑制效果。对荷瘤小鼠体重无明显影响,对其重要组织器官无明显毒性,但却能抑制肿瘤的体积(空白组:425±48mm3,光动力处理组:179±34mm3),和肿瘤的质量(空白组:584±88mg,光动力处理组:335±77mg),达到治疗肿瘤的效果。这些结果表明,新型光敏活性化合物3B无论在小鼠体内研究或者细胞体外研究均具有较好的治疗效果。通过对化合物进行结构解析,能够从化合物结构上理论探索其潜在的抗肿瘤作用。本研究通过计算机分子对接实验发现,3B能够在理论上与TGF-βR1相结合,从而影响TGF-βR1与其配体的结合,进而影响由TGF-β所活化的lnc-ATB的表达。同时,使用q-PCR实验验证了新型光敏活性化合物3B能够抑制lnc-ATB的表达,结果与理论实验相一致。后续对lnc-ATB进行更深入的研究。结果发现,lnc-ATB在胃癌组织中异常高表达,表明lnc-ATB表达量对胃癌的临床诊断具有部分指导作用。敲低lnc-ATB能够使得肿瘤细胞在S期阻滞,从而影响细胞的增殖情况,并且能够影响周期相关蛋白的表达。同时,本研究探索了lnc-ATB调控人胃癌细胞株周期阻滞的分子机制。结果显示,lnc-ATB能够通过调控miR-141-3p,进而影响其下游靶基因TGF-β2。因此,本研究发现了Lnc-ATB/miR-141-3p/TGF-β2反馈循环通路在胃癌细胞中发挥着的重要作用。综上所述,本研究首次将羰非那烯类衍生物运用于光动力治疗,分别从体内和体外两个方面对新型光敏活性化合物3B的抗肿瘤作用进行了多方面的探索,揭示了该化合物3B抑制肿瘤细胞增殖的作用机理以及其作用靶点。为进一步开发研究抗肿瘤的新药提供了科学的实验基础,为后续抗癌化合物的开发拓宽了思路。