丙泊酚抑制过氧化氢所致的脊髓星形胶质细胞的损伤.doc

丙泊酚抑制过氧化氢所致的脊髓星形胶质细胞的损伤第一部分成年大鼠脊髓星形胶质细胞的培养目的：研究成年大鼠脊髓星形胶质细胞(astrocytes,AS)的体外培养、分离和纯化的方法。为进一步研究星形胶质细胞的生物学特性和脊髓损伤(spinalcordinjury,SCI)提供实验模型。方法：采用原代培养和传代培养成年大鼠脊髓星形胶质细胞。无菌条件下取出成年大鼠胸段的脊髓,将脊髓剪碎用胰酶二次消化法,与机械吹打相结合使细胞分散,制成单细胞悬液,接种于无底物粘附的培养瓶中,置于37℃,5%CO2细胞培养箱中。利用差速黏附处理以去除成纤维细胞成分。培养10-14天,待细胞融合达90%左右时利用摇床纯化细胞,舍弃含脱落细胞(小胶质细胞、少突胶质细胞及神经元)的细胞悬液,接着培养,待细胞长满培养瓶底时传代,观察传代细胞形态并对传代后的星形胶质细胞行免疫荧光鉴定。结果：运用差速粘附法、恒温震荡及传代获得了较高纯度、形态典型的脊髓源性星形胶质细胞。免疫细胞化学染色显示：波形蛋白(vimentin)染色为阳性,阳性染色细胞高达100%,但胶质纤维酸性蛋白(glialfibrillaryacidicprotein,GFAP)阳性染色细胞低。结论：体外培养的成年大鼠脊髓星形胶质细胞可作为研究星形胶质细胞模型,也为研究脊髓损伤时星形胶质细胞的保护提供理想模型。培养的成年大鼠的星形胶质细胞GFAP阳性染色率较低。第二部分丙泊酚抑制过氧化氢(H202)所致的脊髓星形胶质细胞的损伤目的：研究丙泊酚对H202所致的脊髓星形胶质细胞损伤的作用及其作用机理。方法：在大鼠脊髓星形胶质细胞培养的基础上,取第三代培养物用于以下实验。使用四甲基偶氮盐(MTT)法筛选适宜的过氧化氢浓度。在此浓度下观察脂肪乳剂及不同浓度丙泊酚对星形胶质细胞活力的影响。将星形胶质细胞随机分为①正常对照组：正常DMEM-F12培养基；②脂肪乳剂组；③H2O2损伤组：等终浓度的H2O2400μmol/L孵育30分钟换液,继续培养4h；④丙泊酚组：丙泊酚浓度为100μmo1/L,孵育4h。⑤丙泊酚+H2O2处理组：分别为25、50、100μmol/L3个浓度,预处理30min,再加入等终浓度的H2O2400μmol/L30分钟换液,继续培养4h；⑥脂肪乳剂+H2O2处理组：脂肪乳剂处理后,加入等终浓度的H2O2400μmol/L30分钟换液,继续培养4h。上述各组实验完成后分别收集每组培养液和细胞,接着进行相关指标的检测。于倒置显微镜下观察各组细胞形态和结构的改变并拍照,用MTT法测各组细胞活性,比色法测MDA含量,ELISA法测LDH乳酸脱氢酶含量。结果：H2O2400μmol/L浓度具有明显的细胞毒作用,细胞活力下降、LDH和MDA增加,和对照组相比较,具有统计学意义(P<0.05)。和H202损伤组比较,三个浓度的丙泊酚+H202处理组细胞活力增加(P<0.05),明显减少LDH漏出和抑制MDA增加,且呈剂量依赖性(P<0.05),有统计学意义。提示丙泊酚对H202所致的星形胶质细胞损伤有拮抗作用,此作用呈剂量依赖性。脂肪乳剂无此作用。于倒置相差显微镜下表明,正常对照组星形胶质细胞形态正常；H202损伤组细胞明显肿胀,折光性增强,部分细胞脱落漂浮,胞质变少、透明,胞核浓缩突出,细胞突起回缩；而给予丙泊酚处理30min后加入H202,星形胶质细胞形态变化不大,细胞突起较H202损伤组清晰,胞体立体感较好。结论：H202损伤星形胶质细胞,使细胞活力下降,LDH漏出量和MDA含量增加。丙泊酚干预后,对H202所致的星形胶质细胞的损伤有保护作用,呈剂量效应关系。丙泊酚可能通过抑制氧化应激对H202所致的星形胶质细胞损伤产生保护作用。