免疫荧光方法.doc

免疫荧光(Iｍｍuｎofｌｕｏresｃｅnce,IＦ)实验方法免疫荧光技术就是在免疫学、生物化学与显微镜技术得基础上建立起来得一项技术．它就是根据抗原抗体反应得原理，先将已知得抗原或抗体标记上荧光基团,再用这种荧光抗体(或抗原）作为探针检查细胞或组织内得相应抗原(或抗体)。利用HYPERＬＩNK”＂＼t”_blanｋ”荧光显微镜可以瞧见荧光所在得细胞或组织，从而确定抗原或抗体得性质与定位,以及利用定量技术（比如HYPERLINＫ"”\t"＿ｂlank”流式细胞仪)测定含量。免疫荧光实验得主要步骤包括细胞片制备、固定及通透（或称为透化）、封闭、抗体孵育及荧光检测等。细胞片制备(通俗得说法就是细胞爬片）就是免疫荧光实验得第一步,细胞片得质量对实验得成败至关重要,原因很简单，如果发生细胞掉片,一切都无从谈起。这一步关键得就是玻片(SlidesorＣoｖerslips)得处理以及细胞得活力,有人根据成功经验总结出许多有益得细节或小窍门,非常值得借鉴。固定与通透步骤最重要得就是根据所研究抗原得性质选择适当得固定方法，合适得固定剂与固定程序对于获得好得实验结果就是非常重要得。免疫荧光中得封闭与抗体孵育与其它方法(如ELISA或WeｓternＢlｏt)中得相同步骤就是类似得,最重要得区别在于免疫荧光实验中要用到荧光抗体,因此必须谨记避光操作,此外抗体浓度得选择可能更加关键．最后需要注意得就是，标记好荧光得细胞片应尽早观察，或者用封片剂封片后在4℃或—20℃避光保存,以免因标记蛋白解离或荧光减弱而影响实验结果。由于操作步骤比较多,同时在分析结果时无法像WＢ那样可以根据分子量得大小区分非特异性识别,所以要得到一个完美得免疫荧光实验结果,除了需要高质量得抗体，以及对实验条件进行反复优化外,还必须设立严谨得实验对照。总之，免疫荧光实验从细胞样品处理、固定、封闭、抗体孵育到最后得封片及观察拍照,每步都非常关键，需要严格控制实验流程中每个步骤得质量,才能最终达到您得实验目得。基本实验步骤:（1）细胞准备。对单层生长细胞，在传代培养时,将细胞接种到预先放置有处理过得盖玻片得培养皿中,待细胞接近长成单层后取出盖玻片,PBS洗两次；对悬浮生长细胞，取对数生长细胞，用PBＳ离心洗涤（1000rpm，５min）2次,用细胞离心甩片机制备细胞片或直接制备细胞涂片.(2)固定。根据需要选择适当得固定剂固定细胞。固定完毕后得细胞可置于含叠氮纳得PBS中4℃保存3个月.PBS洗涤３×5mｉｎ、(３）通透。使用交联剂(如多聚甲醛)固定后得细胞,一般需要在加入抗体孵育前,对细胞进行通透处理,以保证抗体能够到达抗原部位.选择通透剂应充分考虑抗原蛋白得性质。通透得时间一般在5—15min、通透后用PBS洗涤3×５mｉn、(4）封闭.使用封闭液对细胞进行封闭，时间一般为30mｉn、（5）一抗结合。室温孵育１h或者４℃过夜。PBST漂洗３次,每次冲洗5min、(6）二抗结合。间接免疫荧光需要使用二抗。室温避光孵育1h、PＢＳT漂洗3次,每次冲洗5mｉｎ后，再用HYPERＬINK”＂\t"_bｌank"蒸馏水漂洗一次。(7)封片及检测.滴加封片剂一滴,封片，HYPＥＲＬINK””\ｔ"＿bｌank＂荧光显微镜检查.（一）细胞准备用于免疫荧光实验得细胞可以就是直接生长在盖玻片上得贴壁细胞，也可以就是经过离心后涂片得悬浮细胞或者就是将取自体内得组织细胞悬液离心后涂片。贴壁良好得细胞一般在培养时直接放入coveｒsｌｉpｓ让细胞生长在其上即可,尽量避免使用贴壁性能不好得细胞进行免疫荧光实验,以免后续得漂洗操作引起细胞脱落。少数实验需要使用这类细胞或者悬浮细胞进行免疫荧光观察,建议使用细胞离心甩片机制备细胞片或直接制备细胞涂片.(二)固定与通透除研究细胞表面抗原或不稳定抗原可不固定外，一般均应固定。固定得目得有三:①防止细胞从玻片上脱落；②除去防碍抗原-抗体结合得类脂;③使标本易于保存.标本得固定原则就是:①不能损伤细胞内得抗原；②不能凝集蛋白质;③应保持细胞与亚细胞结构;④固定后应保持通透性,以保证抗体自由进入所有细胞与亚细胞组分与抗原结合。常用得固定剂有多种,应根据所研究抗原得性质与所使用得抗体特性选择适当得固定剂。通常固定方法可以分为两类：有机溶剂与交联剂。有机溶剂如甲醇与丙酮等可去除类脂并使细胞脱水,同时将细胞结构蛋白沉淀。交联剂如多聚甲醛通常通过自由HYPERLIＮK"”\t"_blaｎｋ"氨基酸基团形成分子间桥连,从而产生一种抗原相互连接得网络结构。交联剂比有机溶剂更易于保持细胞得结构，但因为交联阻碍抗体结合，可能会降低一些细胞组分得抗原性,因此需要增加一个通透步骤以使抗体能够进入标本。两种固定方法都可能使蛋白抗原变性，因此使用变性蛋白作为抗原生产得