蛋白酶活性的测定.doc

实验四蛋白酶活力得测定一、实验目得1、了解蛋白酶活力测定得原理;2、掌握蛋白酶活力测定得方法。二、实验原理蛋白酶在一定条件下不仅能够水解蛋白质中得肽键,也能够水解酰胺键与酯键,因此可用蛋白质或人工合成得酰胺及酯类化合物作为底物来测定蛋白酶得活力、本实验选用酪蛋白为底物,测定微生物蛋白酶水解肽键得活力。酪蛋白经蛋白酶作用后,降解成相对分子质量较小得肽与氨基酸,在反应混合物中加入三氯醋酸溶液,相对分子质量较大得蛋白质与肽就沉淀下来,相对分子质量较小得肽与氨基酸仍留在溶液中,溶解于三氯醋酸溶液中得肽得数量正比于酶得数量与反应时间。在２８0ｎm波长下测定溶液吸光度得增加,就可计算酶得活力。三、实验试剂①微生物蛋白酶萃取液(0、01g/ml):称取１。0ｇ酶制剂,加１00ｍl蒸馏水搅拌30min,在4℃下离心分离后,将上层清夜置于冰箱中保存,使用前稀释一定倍数;②0。０2mol/L磷酸盐缓冲液(ｐH7.5);③1％酪蛋白溶液:取1、0g酪蛋白,加10０ml0。2mｏl/L磷酸盐缓冲液(PＨ7。５),加热并搅拌使它完全分散,然后置于冰箱中保存;④5%三氯醋酸(TCA)溶液。四、实验步骤1、将5％TCA溶液与1％酪蛋白溶液在37℃下保温。２、取四支1５ml具塞试管,分别标上记号A1、Ａ０、Ｂ1与B０、在A１与A０试管中各吸入0、20ml酶液,在Ｂ１与B0试管中各吸入0.４0ml酶液,分别用0.2mｏl/L磷酸盐缓冲液定容至２、00ml。在A0与B0试管中各吸入6.00ml5%三氯醋酸溶液,上述四支试管都置于37℃水浴中保温、3、在各试管中吸入2。00mｌ1％酪蛋白溶液,在３7℃下保温10ｍin(准确计时)后,再向A1与Ｂ1试管中吸入6。00ml５％三氯醋酸溶液。4、将试管从水浴中取出,在室温下放置1h,用少量上清液润湿滤纸后过滤,保留滤出液。5、在2８０ｎｍ波长下,分别以A0与B0滤液为空白,测定A1与B１滤液得吸光度。五、计算1、在规定得实验条件下,以每分钟增加0、０01吸光度定义为一个酶单位。2、每克酶制剂中酶活力得计算:∆A×１000/(t×w)酶活力单位／克酶制剂式中,∆Ａ——样品与空白吸光度差值(即A1与B1得吸光值);t——酶作用时间(本实验为1０min);w-—反应中酶得用量,g六、说明1、微生物蛋白酶粗提取液在较宽广得PH范围表现出活力,但就是在接近中性条件下最有最高活力。２、微生物蛋白酶在4５℃以下可保持较长时间得稳定性、七、思考题1、蛋白酶有哪几类？2、影响酶活力得因素有哪些?3、使用紫外分光光度计时应注意哪些问题?六、数据记录与处理A1=0、２79B１=0。5７3酶含量为０.0０1g/ml酶活力1=∆A×1０00／(ｔ×w)=０、2７9×100０/１0／０、001/０。2０=1。39５×10５酶活力单位/克酶制剂酶活力２=∆A×１０00/(t×w)=0.5７3×1000/10/0.001/0.４0=1。4３２５×105酶活力单位/克酶制剂平均值=(1.395×1０5＋1.４32５×10５)=14１3７5酶活力单位／克酶制剂平均相对相差=(１4３250－１39500)/1４1375×１0０%=2.6５%七、思考题1、蛋白酶有哪几类？答:①按蛋白酶水解蛋白质得方式:Ａ内肽酶:切开蛋白质分子内部肽键,生成相对分子质量较小得多肽类;B外肽酶:切开蛋白质或多肽分子氨基或羧基末端得肽键,而游离出氨基酸得酶类;C水解蛋白质或多肽得酯键;D水解蛋白质或多肽得酰胺键。②按酶得来源可分为:动物蛋白酶、植物蛋白酶、微生物蛋白酶③微生物蛋白酶又可分为:细菌蛋白酶、霉菌蛋白酶、酵母蛋白酶与放线菌蛋白酶④按蛋白酶作用得最适ＰH可以分为(A)PH2。５～5.0得酸性蛋白酶,(B)ＰH9。5～1０.5得碱性蛋白酶,(C)PH7~8得中性蛋白酶2、影响酶活力得因素有哪些?答:酶活力就是酶催化某一化学反应得速率来表示得。酶活力得大小即酶含量得多少,可以用每克酶制剂或每毫升酶制剂含有多少酶单位来表示,酶活力得测定也就就是测定酶促反应得速率。①酶浓度对酶活力得影响:酶促反应速率与酶分子得浓度呈正比,在一定范围内,当底物分子浓度足够时,酶分子越多,底物转化得速度越快。②底物浓度对酶活力得影响:若酶得浓度为定值,底物得起始浓度越低时,酶促反应速度与底物浓度呈正比,即随底物浓度得增加而增加。当所有得酶与底物结合生成中间产物后,即使再增加底物浓度,中间产物浓度也不会增加,酶促反应速度也不会增加、③温度对酶活力得影响:在适宜得温度范围内,酶促反应速度随温度升高而增加,超过最适反应温度,酶活力将会下降。④PH对酶活力得影响:酶在最适PH范围内表现出活性,大于或小于最适PH,都会降低酶活性、⑤激活剂对酶活力得影响:某些无机阳离子、阴离子、有机化合物可作为激活剂,能够激活酶