一种直接提取并扩增牛奶中无乳链球菌核酸的快速试纸条检测方法.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN116004866A(43)申请公布日2023.04.25(21)申请号202211451472.XG01N33/569(2006.01)(22)申请日2022.11.20(71)申请人南京农业大学地址210095江苏省南京市玄武区卫岗1号(72)发明人潘子豪朱玲玲李漪如于勇殳婕马家乐姚火春(74)专利代理机构南京经纬专利商标代理有限公司32200专利代理师唐循文(51)Int.Cl.C12Q1/689(2018.01)C12Q1/6844(2018.01)C12N15/11(2006.01)G01N33/558(2006.01)G01N33/58(2006.01)权利要求书1页说明书7页序列表（电子公布）附图5页(54)发明名称一种直接提取并扩增牛奶中无乳链球菌核酸的快速试纸条检测方法(57)摘要一种直接提取并扩增牛奶中无乳链球菌核酸的快速试纸条检测方法，采用高分子纤维素载体核酸提取法提取牛奶中的细菌核酸；以上述提取得到的细菌核酸为模板，进行MIRA扩增，得扩增产物；应用胶体金免疫层析试纸条进行扩增产物检测。本发明使核酸提取过程缩短为2min。本发明将高分子纤维素提取、MIRA等温扩增、胶体金免疫层析试纸条结合，构建了直接检测牛奶中无乳链球菌的快速检测方法，实现了直接从牛奶中检测无乳链球菌，该检测发明仅耗时不到15min,最低检测限为3.52×102CFU/mL，具有检测时间短、成本低廉、灵敏度高、操作简便、无需实验室设备等特点，适合在条件有限的牧场进行检测。CN116004866ACN116004866A权利要求书1/1页1.一种直接提取并扩增牛奶中无乳链球菌核酸的快速试纸条检测方法，其特征在于，步骤为：（1）采用高分子纤维素载体核酸提取法提取牛奶中的细菌核酸；（2）以上述提取得到的细菌核酸为模板，进行MIRA扩增，得扩增产物；（3）应用胶体金免疫层析试纸条进行扩增产物检测；所述步骤（2）中MIRA扩增反应体系如下：将29.4μLAbuffer加入冻干酶粉中，随后依次加入11.5μLddH2O，2μLDNA模板，2μL10μM上游引物MIRA‑cfb‑F，2μL10μM标记的下游引物MIRA‑cfb‑R，0.6μL10μM标记的探针MIRA‑cfb‑p，待所有预混体系配制完后，将2.5μLMgAc加于盖上，随后进行离心，涡旋混匀，于38℃反应10min；所述胶体金免疫层析试纸条进行扩增产物检测方法具体为：首先将扩增产物按体积比进行1:200稀释，随后取200μL稀释液滴于胶体金试纸条加样区；2min后，取出试纸条进行观察，当试纸条上出现两条红色条带，一条位于检测线，一条位于质控线上时，则结果为阳性，表明待测奶样中含有无乳链球菌；当试纸条上只有一条红色条带，位于质控线上时，则结果为阴性，表明待测奶样中不含有无乳链球菌；当质控线上无条带时，表明结果无效。2.根据权利要求1所述直接提取并扩增牛奶中无乳链球菌核酸的快速试纸条检测方法，其特征在于，所述正向引物MIRA‑cfb‑F如SEQIDNO.1所示；反向引物MIRA‑cfb‑R如SEQIDNO.2所示；所述探针序列MIRA‑cfb‑p如SEQIDNO.3所示。3.根据权利要求2所述直接提取并扩增牛奶中无乳链球菌核酸的快速试纸条检测方法，其特征在于，所述反向引物MIRA‑cfb‑R的5’端带有生物素（biotin）标记，所述探针MIRA‑cfb‑p的5’端带有荧光素（FAM）标记，3’端带有C3‑spacer，第32处碱基由四氢呋喃（THF）取代。4.根据权利要求1所述直接提取并扩增牛奶中无乳链球菌核酸的快速试纸条检测方法，其特征在于，所述采用高分子纤维素载体核酸提取法提取牛奶中的细菌核酸的具体步骤为：首先将100μL待测奶样与500μL裂解液混合，用核酸提取装置反复吹打30s进行细菌裂解，排净混合液；接着用核酸提取装置反复吹打200μL洗脱液20次进行洗脱，排净洗脱液；最后将纤维素滤纸圆片取出，此时微生物的核酸结合或吸附与滤纸圆片上，该滤纸圆片即可作为核酸模板用于后续试验。5.根据权利要求4所述直接提取并扩增牛奶中无乳链球菌核酸的快速试纸条检测方法，其特征在于，所述裂解液配方为1.5M异硫酸氰胍，50mMpH=8.0Tris‑HCl，20mMEDTA，1%Tween‑20，2mg/mLDTT，40mg/mLTtiton×100，100mMNaCl，调整pH=8.0。6.根据权利要求4所述直接提取并扩增牛奶中无乳链球菌核酸的快速试纸条检测方法，其特征在于，所述洗脱液组成为10mMpH=8.0Tris‑HCl，0.1%Tween‑20。7.根据权利要求4所述直接提取并扩增牛奶中无乳链球菌核酸的快速试纸条检测方法，其特征