热稳定性提高的D-阿洛酮糖3-差向异构酶突变体及其应用.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN116004598A(43)申请公布日2023.04.25(21)申请号202211704765.4C12P19/02(2006.01)(22)申请日2022.12.29C12R1/19(2006.01)(71)申请人浙江工业大学地址310000浙江省杭州市拱墅区潮王路18号(72)发明人金利群张靖伟郑琳柳志强蔡雪贾东旭郑裕国(74)专利代理机构浙江千克知识产权代理有限公司33246专利代理师冷红梅(51)Int.Cl.C12N9/90(2006.01)C12N15/61(2006.01)C12N15/70(2006.01)C12N1/21(2006.01)权利要求书1页说明书6页序列表（电子公布）附图2页(54)发明名称热稳定性提高的D-阿洛酮糖3-差向异构酶突变体及其应用(57)摘要本发明筛选得到一种耐高温D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶突变体，增强了突变酶的半衰期，提高了酶对合成D‑阿洛酮糖所用底物D‑果糖的底物亲和力和转化效率，突变体酶A13S在50℃时的t1/2值300min，Tm值由野生酶的55.1℃分别上升为60.8℃，突变体酶最适温度上升为80℃，与野生酶相比提高了20℃；本发明通过突变改善野生酶高温下半衰期过短问题，突变酶相对作用时间长，扩展了相对稀少的酶库，展示了D‑果糖在合成D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶绿色环保、毒性低，副产物少的技术优势，克服了化学合成法易产生三废问题，具有重要的工业应用前景。CN116004598ACN116004598A权利要求书1/1页1.一种D‑阿洛酮糖3差向异构酶突变体，由序列如SEQIDNO.2所示的氨基酸经突变获得，所述突变位点为第13位氨基酸。2.如权利要求1所述的D‑阿洛酮糖3差向异构酶突变体，其特征在所述D‑阿洛酮糖3差向异构酶突变体氨基酸序列如SEQIDNO.4所示。3.编码权利要求1所述D‑阿洛酮糖3差向异构酶突变体的基因。4.含有权利要求3所述编码基因的重组菌。5.权利要求1或2所述D‑阿洛酮糖3差向异构酶突变体在微生物催化D‑果糖异构化制备D‑阿洛酮糖的应用。6.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述应用为：以含D‑阿洛酮糖3差向异构酶突变体基因的重组基因工程菌经摇瓶发酵诱导培养获得的湿菌体为酶源，以D‑果糖为底物，以钴离子为助催剂，以pH9.0的缓冲液为反应介质，在50～90℃、100～200r/min条件下反应，反应完全后，获得D‑果糖和D‑阿洛酮糖混合物。7.如权利要求7所述的应用，其特征在于反应体系中，湿菌体用量为50～150g/L，钴离子终浓度为0.1～10mM，底物初始浓度为50～500g/L。8.如权利要求7所述的应用，其特征在于所述湿菌体按如下方法制备获得：将含D‑阿洛酮糖3差向异构酶突变体基因的重组基因工程菌接种至含终浓度50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、200r/min培养至OD600＝0.8～1.0，获得种子液；种子液以体积浓度1～5％的接种量转入含终浓度50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，于37℃、180r/min培养至OD600＝0.6～0.8，添加终浓度0.1mM的IPTG，于28℃、180r/min诱导培养12～14h，获得诱导培养菌悬液，将诱导培养菌悬液离心，收集得到湿菌体。2CN116004598A说明书1/6页热稳定性提高的D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶突变体及其应用(一)技术领域[0001]本发明涉及一种热稳定性提高的D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶突变体及其编码基因，以及其在微生物催化D‑阿洛酮糖异构化制备D‑果糖和D‑阿洛酮糖混合物的应用。(二)背景技术[0002]D‑阿洛酮糖是D‑果糖的C‑3差向异构体。在立体化学中，含有多个手性碳原子的立体异构体，除了一个手性碳原子的构型不相同，其余的构型都相同的非对映体，叫做差向异构体，也称作差向立体异构体。D‑阿洛酮糖作为一种新型功能性稀少糖，近来研究表明D‑阿洛酮糖还具有很多生理功能，并且在膳食、医药、保健等领域具有重要应用潜力，吸引着越来越多国内外科学家的广泛关注。因此开发天然健康稀有糖代替已有的甜味剂成为研究热点。而日本厚生省批准可应用于食品生产中，并于2011年注册了阿洛酮糖的商标并正式申请了特定保健食品。美国食品药物管理局(FDA)也认定D‑阿洛酮糖为食品安全级GRAS。[0003]目前在生产D‑阿洛酮糖的方法中认为生物法制备D‑阿洛酮糖是最为有效的方法是寻找能使D‑果糖转变为D‑阿洛酮糖的酶。然而，目前的DAE酶对果糖催化活性低，且温度稳定性差等问题不适合工业化生产D‑阿洛酮糖。随着D‑阿洛酮糖的市场需求量的日益增加，高效的生物催化剂的开发对其工业应用至关重要。[0004]为满足工业化应用的需求，不