基于固相捕获和滚环扩增放大靶标信号的定量检测方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN113699216A(43)申请公布日2021.11.26(21)申请号202111010172.3(22)申请日2021.08.30(71)申请人中国药科大学地址211198江苏省南京市江宁区龙眠大道639号(72)发明人邹秉杰王琛宋沁馨(74)专利代理机构南京苏高专利商标事务所(普通合伙)32204代理人王艳(51)Int.Cl.C12Q1/682(2018.01)C12Q1/6834(2018.01)G01N15/14(2006.01)权利要求书1页说明书11页序列表1页附图3页(54)发明名称基于固相捕获和滚环扩增放大靶标信号的定量检测方法(57)摘要本发明公开了基于固相捕获靶标，结合滚环扩增放大靶标信号的定量检测方法。所述检测方法通过将待测分析样本与至少一种固体支持物相连，然后将靶标特异性结合组合物与待测分析样本中的靶标相连，该靶标特异性结合组合物包含有寡核苷酸，以该寡核苷酸为引物介导环状核酸分子的滚环复制得到球状滚环复制产物，通过对滚环复制产物的量化分析从而实现对分析物的定量检测。本发明还涉及显微成像检测和流式细胞术对样本进行定量分析。CN113699216ACN113699216A权利要求书1/1页1.基于固相捕获和滚环扩增放大靶标信号的定量检测方法，其特征在于，所述检测方法通过将待测分析样本与至少一种固体支持物相连，然后将靶标特异性结合组合物与待测分析样本中的靶标相连，该靶标特异性结合组合物包含有寡核苷酸，以该寡核苷酸为引物介导环状核酸分子的滚环复制得到球状滚环复制产物，通过对滚环复制产物的量化分析从而实现对分析物的定量检测。2.根据权利要求1所述的基于固相捕获和滚环扩增放大靶标信号的定量检测方法，其特征在于，所述待测分析样本包括细胞或细胞分泌物，所述细胞包括循环肿瘤细胞，所述细胞分泌物包括外泌体，所述固体支持物包括微球、微粒、成型的聚合物、薄膜、玻璃制品或金属制品或它们的组合。3.根据权利要求1所述的基于固相捕获和滚环扩增放大靶标信号的定量检测方法，其特征在于，所述靶标包括DNA、RNA、蛋白质、多肽或蛋白多糖。4.根据权利要求1所述的基于固相捕获和滚环扩增放大靶标信号的定量检测方法，其特征在于，所述靶标特异性结合组合物是非共价或共价偶联或连接到寡核苷酸的特异性结合分子，所述特异性结合分子是一种抗体、抗体片段，一种适体，一种寡核苷酸或一种小分子，并且具有靶标结合特异性。5.根据权利要求1所述的基于固相捕获和滚环扩增放大靶标信号的定量检测方法，其特征在于，所述靶标特异性结合组合物中的寡核苷酸每经过一次环状单链DNA分子长度的延伸之后，就会在其3’端增加一段与环状单链DNA分子互补的序列，最终经过多次扩增延伸，靶标特异性结合组合物中的寡核苷酸形成一条具有多段序列与所述环状单链DNA分子互补的长单链DNA扩增产物，该长单链DNA扩增产物能够自发卷曲形成几百纳米尺寸的DNA纳米球结构即为球状滚环复制产物。6.根据权利要求5所述的基于固相捕获和滚环扩增放大靶标信号的定量检测方法，其特征在于，所述滚环复制中使用具有DNA连接活性的酶和链置换活性的DNA聚合酶使特异性单链DNA分子连接成环并进一步使成环的单链DNA分子扩增延伸形成长单链DNA扩增产物，并形成DNA纳米球。7.根据权利要求5所述的基于固相捕获和滚环扩增放大靶标信号的定量检测方法，其特征在于，所述量化分析采用显微成像检测和流式细胞术分析实现。8.根据权利要求7所述的基于固相捕获和滚环扩增放大靶标信号的定量检测方法，其特征在于，所述显微成像检测技术是落射荧光或共聚焦显微镜检术。2CN113699216A说明书1/11页基于固相捕获和滚环扩增放大靶标信号的定量检测方法技术领域[0001]本发明属于分析物鉴定与量化检测的领域，具体涉及基于固相捕获和滚环扩增放大靶标信号的定量检测方法。背景技术[0002]据世界卫生组织最新数据表明，2020年中国平均每分钟有8人被确诊癌症，并且该组织指出，约1/3的癌症可以通过早期诊断发现，从而能及时利用特定的医疗措施延长患者生命、减轻癌症痛苦，甚至治愈疾病。例如，在医学界被称为“癌症之王”的胰腺癌是一种恶性程度很高的消化道肿瘤，大部分胰腺癌患者被确诊时已经伴有至少一处远端转移，并且已不适合开展治愈性手术切除，而对于进展期的胰腺癌患者仍然缺乏行之有效的治疗方式，预后较差。因此，癌症的早期筛查及诊断对于提高癌症治愈率、延长患者生命、提高患者生存质量、改善疾病预后状态均具有非常重要的临床意义。[0003]近几年，外泌体因其在指示癌症病理信息方面的重要作用而受到特别关注，正逐渐成为肿瘤早期诊断和预后的生物标志物之一。外泌体是30～150nm的细胞外囊泡，由正常细胞