一种核酸单碱基突变检测的方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN110777193A(43)申请公布日2020.02.11(21)申请号201911112259.4(22)申请日2019.11.14(71)申请人华东师范大学地址200062上海市普陀区中山北路3663号(72)发明人裴昊杨海红赖魏李丽(74)专利代理机构上海德禾翰通律师事务所31319代理人陈艳娟(51)Int.Cl.C12Q1/6827(2018.01)权利要求书1页说明书8页序列表2页附图2页(54)发明名称一种核酸单碱基突变检测的方法(57)摘要本发明公开了一种核酸单碱基突变的检测方法，通过锁式探针成环，通用引物1延伸，阻断剂和引物2特异性竞争引发超支化滚环扩增突变型核酸，从而达到检测突变的目的。所述方法从动力学角度解决了常规热力学方法检测核酸单碱基突变时的温度敏感性问题，克服了PCR需要变温及昂贵的缺点，同时提高了滚环扩增检测单碱基突变的灵敏度和特异性；将合理的竞争杂交反应与滚环等温扩增技术结合，使得可以灵敏地识别和选择性恒温扩增等位基因频率为0.1％的单碱基突变，可以对完整基因组DNA中包含的低频率单碱基未知突变进行简便、快速和高选择性等温扩增检测。可以用于癌症相关突变的检测，具有潜在的应用价值。CN110777193ACN110777193A权利要求书1/1页1.一种核酸单碱基突变的检测方法，其特征在于，该方法的具体步骤为：(1)样品制备：向基因组DNA中加入内切酶进行DNA片段化，得到片段化DNA；(2)杂交连接：向所述步骤(1)得到的片段化DNA中加入锁式探针、dNTPs、聚合酶和连接酶进行靶标杂交、填充和连接成环，再加入核酸外切酶I和核酸外切酶III进行消化，得到环；(3)阻断扩增：向所述步骤(2)消化后得到的环中加入阻断剂、引物1、引物2、dNTPs、聚合酶进行选择性扩增，得到扩增产物；(4)检测分析：然后对所述步骤(3)得到的扩增产物进行定性分析或者进行定量分析。2.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述基因组DNA中待检测片段的序列如SEQIDNO.1或SEQIDNO.2所示。3.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤(2)中，所述聚合酶为TaqDNA聚合酶、T4DNA聚合酶、T7DNA聚合酶中的一种或多种；和/或，所述连接酶为Ampligase连接酶、T4DNA连接酶、TaqDNA连接酶中的一种或多种；和/或，所述聚合酶的浓度为0.2-0.5U/μL；和/或，所述连接酶的浓度为0.2-1.0U/μL；和/或，所述核酸外切酶Ⅰ的浓度为0.2-0.5U/μL；和/或，所述核酸外切酶Ⅲ的浓度为5-20U/μL；和/或，所述锁式探针的序列如SEQIDNO.3所示。4.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤(2)中，所述连接温度为16-60℃；和/或，所述连接时间为1-10小时；和/或，所述消化的温度为37℃；和/或，所述消化的时间为1-4h。5.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤(3)中，所述阻断剂和引物2的比例为1-10：1；和/或，所述阻断剂和引物1的摩尔比为1-10：1；和/或，所述引物1的浓度为0.1～1μM；和/或，所述引物1的序列如SEQIDNO.6所示；和/或，所述引物2的浓度为0.1～1μM；和/或，所述引物2的序列如SEQIDNO.7或SEQIDNO.8所示；和/或，所述dNTPs的浓度为200～400μM。6.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤(3)中，所述聚合酶为vent(exo-)DNA聚合酶、BsuDNA聚合酶、Bst3.0DNA聚合酶中的一种或多种；和/或，所述聚合酶的浓度为0.1-0.4U/μL。7.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤(3)中，所述阻断剂被设计为与已知的野生型目标序列完全互补，所述引物2序列的3'末端与所述阻断剂序列的5'末端有6～14nt重叠区域，所述阻断剂的3'末端含有12～30nt序列，其不存在于所述引物2中，其中，所述野生型目标序列如SEQIDNO.4或SEQIDNO.5所示；和/或，所述阻断剂的浓度为0.1～10μM；和/或，所述阻断剂的序列如SEQIDNO.10所示。8.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤(3)中，所述扩增的温度为58～63℃；和/或，所述扩增的时间为45-120min。9.如权利要求1所述的检测方法在提取的DNA或RNA单碱基突变检测中的应用。10.如权利要求1所述的检测方法在细胞原位DNA或RNA单碱基突变检测中的应用。11.如权利要求1所述的检测方法在DNA甲基化检测中的应用。2CN110777193A说明书1/8页一种核酸单碱基突变检测的方法技术领域