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本发明公开了基于非负矩阵分解的多通道荧光显微图像光谱拆分方法。包括S1,获取多通道荧光显微图像,将每个通道的图像作为矩阵P中的列;S2,将P分解为E与A两个矩阵;S3,建立目标函数J1(A)为A的稀疏度惩罚项,J1(A)=|sparseness(A)?spA|,0≤spA≤1;S4,初始化E与A;S5,对目标函数中的E与A迭代求解,输出E和A;S6,将E中每列还原为荧光团图像,A中行表征为对应荧光团的光谱。增加A的稀疏度惩罚项,引入了A的理想稀疏度值spA,通过减去spA,可以使A的稀疏度值更接近理想值,保证A是稀疏的,在迭代过程中实现精准约束,最终减小了拆分后的荧光团图像之间的串扰。