温度控制在蛋白质结晶中的应用研究.docx

温度控制在蛋白质结晶中的应用研究温度控制在蛋白质结晶中的应用研究0前言X射线单晶衍射技术是目前最成功的蛋白质结构检测方法。PDB数据库中已有超过6万个蛋白质结构，而其中85%以上的结构是通过这个方法解析得到的。虽然如此，蛋白质结构解析的速度仍然远低于新功能性蛋白质的研究需求速度。近几年，世界范围内有超过1800个基因组测序工程，其中1500个正在进行，335个已经完成测序工作[1]，已经产生了超过320万非冗余蛋白质序列[2]。因此，必须加快蛋白质结构的解析速度以适应蛋白质序列测序工作的快速发展。目前，生长大的衍射质量的蛋白质晶体仍旧是结构检测的最大障碍[3-5]。成功获得适合衍射的蛋白质晶体分为两个步骤[6]：第一步是筛选结晶条件获得晶体。当前，稀疏矩阵法[7]是应用最广泛的结晶筛选方法，该方法利用大量不同的结晶溶液进行蛋白质结晶来寻找合适的结晶条件。第二步是优化结晶条件获得衍射质量的晶体。蛋白质结晶过程受多种因素影响，如沉淀剂类型、浓度、pH值、温度等。由于溶液的化学条件复杂，大多数研究着重在pH值、盐的类型、浓度和添加剂如聚合体或多羟基化合物等条件上。虽然温度一直以来被认为很重要[8]，但是没有受到足够的重视。传统的蛋白质结晶实验是在恒温条件下进行的，应用最广泛的是277K和293K[9]。事实上很多蛋白质只有在其适合的温度条件下才能结出晶体[10]。温度对蛋白质结晶的影响，从本质上说是由于温度的改变引起蛋白质的溶解度的改变，从而改变过饱和度，继而影响蛋白质的形核和晶体生长过程[11]。Christopher等人[12]任意选择30种蛋白质，发现其中86%的蛋白质其溶解度受到温度的明显影响。通常温度变化1K，溶解度变化约10%[13]。另外，在高沉淀剂浓度下，温度对蛋白质溶解度的影响显著减小[14]。控制温度是重复结晶实验的先决条件[15]。温度的研究主要集中在提高晶体质量[16]，提高结晶筛选成功率[17,18]，溶解性[19-21]，和形核速率测量上[22]。温度诱导方法既可以提高蛋白质结晶筛选的成功率，同时也可以用来获得高质量的蛋白质晶体。利用温度控制蛋白质结晶的方法有很多，我们将对恒温（筛选最佳结晶温度）及变温下的蛋白质结晶研究进行综述。1恒温应用于蛋白质结晶不同蛋白质的最佳结晶温度不同。同一种蛋白质不同溶液体系下，由于溶解度与温度的关系不同[23]，最佳结晶温度也不同。同一种蛋白质，温度影响溶解度的趋势可以通过改变沉淀剂的类型来逆转。如HistamineandV8protease(P6306)[23]在100mMNaAcetate,100mMNH4SCN,20%(w/v)PEG4000，pH5的溶液中，其溶解度随温度增加而增大；而在100mMMOPS,100mMNH4Br,80%(w/v)PEG400，pH7的溶液中，其溶解度随温度增加而减小。大多数情况下，每种蛋白质在特定溶液条件下，均有自己的最佳结晶温度，因此需要考虑结晶温度的优化。1.1溶液局部区域控制温度蛋白质结晶可以通过两种方法实现：一种方法是异相形核，另一种方法是均匀形核。第一种方法需要有诱导形核的表面，而选择合适的表面是这种方法的关键因素。第二种方法中需要形核的过饱和度比晶体生长所需过饱和度高很多，因此，形核的数量和晶核生长的速度都很难控制。温度可以用来控制晶核的形成数量和晶体的生长速度[24]。DeMattei等人[25]发展了一种控制形核和生长的方法，该方法选择接近过饱和的均匀溶液条件，在部分区域改变温度使其到达过饱和，从而控制形核的位置和数量。通过这种方法控制溶液小区域的温度实现更少晶核的形成，成功生长了高质量的溶菌酶晶体。1.2寻找最佳温度用于蛋白质结晶每种蛋白质的最佳结晶温度是不同的。在生长蛋白质晶体过程中，需要寻找最佳结晶温度。由于重组云杉卷叶蛾抗冻蛋白[26]的微观不均一性导致这个蛋白很难结晶，Leinala等[26]