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本发明公开了一种基于静电纺丝法农药残留速测卡及其制备方法和应用,该速测卡包括酶膜和底物膜两部分,酶膜是负载胆碱酯酶的纳米纤维膜,底物膜是负载吲哚乙酸酯的纳米纤维膜,所述酶膜和底物膜是将高分子材料聚乙烯醇分别与活性物质胆碱酯酶、吲哚乙酸酯共混,采用静电纺丝的方法制备的;该速测卡可以应用于检测有机磷及氨基甲酸酯类农药,使用时,将待检测样品滴加于酶膜上预反应,再使酶膜与底物膜接触反应,观察显色。本发明所制备的农残速测卡可重复利用,速测卡酶促反应前后颜色变化明显,检测限低,稳定性好,易于保存。