基因敲除技术.docx

基因敲除技术点击次数：2605发布日期：2023-5-25来源：本站仅供参考，谢绝转载，否则责任自负1．概述：基因敲除是自80年代末以来发展起来的一种新型分子生物学技术，是通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的技术。通常意义上的基因敲除重要是应用DNA同源重组原理，用设计的同源片段替代靶基因片段，从而达成基因敲除的目的。随着基因敲除技术的发展，除了同源重组外，新的原理和技术也逐渐被应用，比较成功的有基因的插入突变和iRNA，它们同样可以达成基因敲除的目的。2．实现基因敲除的多种原理和方法：2．1．运用基因同源重组进行基因敲除基因敲除是80年代后半期应用DNA同源重组原理发展起来的。80年代初，胚胎干细胞（ES细胞）分离和体外培养的成功奠定了基因敲除的技术基础。1985年，初次证实的哺乳动物细胞中同源重组的存在奠定了基因敲除的理论基础。到1987年，Thompsson初次建立了完整的ES细胞基因敲除的小鼠模型[1]。直到现在，运用基因同源重组进行基因敲除仍然是构建基因敲除动物模型中最普遍的使用方法。2.1.1运用同源重组构建基因敲除动物模型的基本环节(图1)：图1.基因同源重组法敲除靶基因的基本环节a．基因载体的构建：把目的基因和与细胞内靶基因特异片段同源的DNA分子都重组到带有标记基因(如neo基因，TK基因等)的载体上，成为重组载体。基因敲除是为了使某一基因失去其生理功能，所以一般设计为替换型载体。b．ES细胞的获得：现在基因敲除一般采用是胚胎干细胞，最常用的是鼠，而兔，猪，鸡等的胚胎干细胞也有使用。常用的鼠的种系是１２９及其杂合体，由于这类小鼠具有自发突变形成畸胎瘤和畸胎肉瘤的倾向，是基因敲除的抱负实验动物。而其他遗传背景的胚胎干细胞系也逐渐被发展应用。[2，3]ｃ．同源重组：将重组载体通过一定的方式(电穿孔法或显微注射)导入同源的胚胎干细胞(EScell)中，使外源DNA与胚胎干细胞基因组中相应部分发生同源重组，将重组载体中的DNA序列整合到内源基因组中，从而得以表达。一般地，显微注射命中率较高，但技术难度较大，电穿孔命中率比显微注射低，但便于使用。[4,5]ｄ．选择筛选已击中的细胞：由于基因转移的同源重组自然发生率极低，动物的重组概率为10－2～10-5，植物的概率为10－4～10－5。因此如何从众多细胞中筛出真正发生了同源重组的胚胎干细胞非常重要。目前常用的方法是正负筛选法（PNS法），标记基因的特异位点表达法以及PCR法。其中应用最多的是PNS法。[6]ｅ．表型研究：通过观测嵌和体小鼠的生物学形状的变化进而了解目的基因变化前后对小鼠的生物学形状的改变，达成研究目的基因的目的。[2，3,7]f．得到纯合体：由于同源重组经常发生在一对染色体上中一条染色体中,所以假如要得到稳定遗传的纯合体基因敲除模型，需要进行至少两代遗传。[8]（见图2）图2.由嵌合体得到基因敲除的纯合体小鼠2.1.2条件性基因敲除法条件性基因敲除法可定义为将某个基因的修饰限制于小鼠某些特定类型的细胞或发育的某一特定阶段的一种特殊的基因敲除方法[2]。它事实上是在常规的基因敲除的基础上，运用重组酶Cre介导的位点特异性重组技术，在对小鼠基因修饰的时空范围上设立一个可调控的“按钮”，从而使对小鼠基因组的修饰的范围和时间处在一种可控状态。条件性敲除的原理（图2，3）：运用Cre／LoxP和来自酵母的FLP—frt系统可以研究特定组织器官或特定细胞中靶基因灭活所导致的表型[7]。通过常规基因打靶在基因组的靶位点上装上两个同向排列的1oxP，并以此两侧装接上loxP的(“loxPfloxed”)ES细胞产生“loxPfloxed”小鼠,然后，通过将“loxPfloxed”小鼠与Cre转基因鼠杂交(也可以其他方式向小鼠中引入Cre重组酶)，产生靶基因发生特定方式(如特定的组织特异性)修饰的条件性突变小鼠。在“loxPfloxed”小鼠，虽然靶基因的两侧已各装上了一个loxP，但靶基因并没有发生其他的变化，故“1oxPnoxed”小鼠表型仍同野生型的同样。但当它与Cre转基因小鼠杂交时，产生的子代中将同时带有“loxPfloxed”靶基因和Cre基因。Cre基因表达产生的Cre重组酶就会介导靶基因两侧的1oxP间发生切除反映，结果将一个loxP和靶基因切除。这样，靶基因的修饰(切除)是以Cre的表达为前提的。Cre的表达特性决定了靶基因的修饰(切除)持性：即Cre在哪一种组织细胞中表达，靶基因的修饰(切除)就发生在哪种组织细胞；而Cre的表达水平将影响靶基因在此种组织细胞中进行修饰的效率。所以只要控制Cre的表达特异性和表达水平就可实现对小鼠中靶基因修饰的特异性和限度[9,10]。图3，运用Cre／LoxP实现靶基因的切除原理图4.条件性基因敲除的基因重组及切