方竹种质资源遗传多样性研究样本.doc

方竹和合江方竹种质遗传多样性研究刘跃钧基金项目：丽水市重点科技合伙项目（筹划编号：4012）作者简介：刘跃钧（1966-），男，浙江松阳人，专家级高工，从事野生植物开发运用研究。；陈世通2王立平3傅兵4（1丽水市林业科学研究院，浙江丽水323000；2丽水九龙国家湿地公园管理处，浙江丽水323000；3遂昌县林业局，浙江遂昌323300；4丽水职业技术学院，浙江丽水323000）摘要：目建立及优化方竹和合江方竹ISSR-PCR反映体系，分析其12个种质资源遗传多样性。办法采用L16（45）正交实验建立、优化ISSR-PCR反映体系，运用该体系分析12个不同种源方竹和合江方竹遗传多样性。成果最佳ISSR-PCR最佳体系为：MgCl22.5mmol/L、dNTPs100μmol/L、Taq0.8U、引物0.1μmol/L、DNA20ng、1×ReactionBuffer。12个供试竹种被分为两大类群，其中除方竹遂昌种源2外其她方竹竹种亲缘关系相称接近，归为一种亚群；合江方竹杭州种源和合江方竹莲都种源归到一种小亚群中。核心词：方竹；合江方竹；分子标记，遗传多样性；研究寒竹属（ChimonobambusaMakino）从属于禾本科植物，其下有八月竹、大明山方竹、寒竹、毛环方竹、武夷山方竹、永善方竹、大叶方竹、合江方竹、云南方竹等20余种。国内拥有所有种类，其重要分布在秦岭以南各省区，比较集中地区如四川、贵州等西南各省区。表1寒竹属12种不同竹种采集地点种质代号种名种源种质采集地点1合江方竹丽水种源丽水市林科院百果园2合江方竹杭州种源浙江省林科院竹种园3方竹莲都种源1莲都区城西村4方竹莲都种源2莲都区大港头镇栋头村5方竹遂昌种源1遂昌县贵阳林场6方竹遂昌种源2遂昌县三仁乡林业站附近7方竹松阳种源1松阳县竹源乡小竹溪村8方竹松阳种源2松阳县三都乡9方竹松阳种源3松阳县竹源乡后畲村10方竹景宁种源景宁县东坑镇杨斜村11方竹庆元种源庆元林场场部12方竹杭州种源浙江省林科院竹种园由于竹子是一类生物学特性特殊植物，以地下鞭延伸为主无性繁殖方式，以及开花时间、空间上不拟定导致有性繁育系统缺少，因此在亲缘关系鉴定，遗传图谱建立等方面都存在着很大困难。ISSR[1](intersamplesequencerepeat)分子标记由于不受环境及发育阶段影响，其技术已经越来越多应用到竹类植物来源、遗传多样性、分类、系统进化及构建遗传图谱等方面研究。运用ISSR分子标记分析浙江省内合江方竹（C．hejiangensis）和方竹（C.quadrangularis）不同种源之间遗传多样性，为此后优良竹种选育等提供理论根据。1材料与办法1.1材料及来源于10月采集浙江省内寒竹属12种不同种质资源（见表1）。其中10种采自丽水地区各县（市、区），2种采自浙江省林业科学研究院竹种园。采得鲜嫩竹叶后，置于-80℃冰箱保存备用。1.2基因组DNA提取用PlantDNAMiniKit试剂盒（OMEGA公司）抽提叶片组织基因组DNA。运用琼脂糖胶电泳检测基因组DNA大小及完整性，并用UV-2802S(上海洪富仪器仪表有限公司)测定基因组DNA浓度和质量。1.3ISSR-PCR反映条件及程序影响PCR成果因素重要为：引物、TaqDNA聚合酶、dNTPs、模板DNA、Mg2+，借鉴杨本超[2]、王涛[3]反映体系及参数，设计5因素4水平正交实验（表2）并运用正交实验进行恰当优化。此外，前期研究发现，反映体系中加入2%(v/v)去离子甲酰胺，1%(v/v)甘油，可提高PCR反映特异性，同步使条带清晰。本研究ISSR-PCR反映程序初步确以为：95℃预变性5min；然后95℃变性45s，50℃(退火温度随引物不同而变化)退火1min30s，72℃延伸1min30s，重复30个循环；最后为72℃延伸10min，4℃保存。表2ISSR-PCR正交设计表编号No．因素和水平FactorandlevelMgCl2(mmol/L)dNTPs(μmol/L)Taq/U引物(μmol/L)DNA/ng11.01000.20.11021.02000.40.22031.03000.60.33041.04000.80.44051.51000.40.34061.52000.20.43071.53000.80.12081.54000.60.21092.01000.60.420102.02000.80.310112.03000.20.240122.04000.40.130132.51000.80.230142.52000.60.140152.53000.40.410162.54000.20.3201.4ISSR引物筛选参照加拿大哥伦比亚大学(UBC)发布第9套ISSR引物序列合成所用ISSR引物，共60条（UB