铁皮石斛组培方案样本.doc

铁皮石斛组织培养方案报告实验目理解铁皮石斛培养办法和环节，纯熟掌握外植体取材、消毒、接种、初代培养操作过程。实验器材超净工作台、高压灭菌锅、电磁炉、长镊子、培养皿、酒精灯、接种工具、烧杯、玻璃棒、移液管、培养箱、剪刀、培养瓶等。实验环节配方：依照不同阶段，培养基配方有所差别。如表1表1各种培养基配方不同阶段培养基备注愈伤组织（原球茎）诱导MS+2.0mg/L6-BA+3%蔗糖+0.8%琼脂pH=5.8原球茎增殖MS+20%马铃薯+3%蔗糖+0.8%琼脂pH=5.8原球茎分化MS+20%马铃薯+2.0mg/LNAA+3%蔗糖+0.8%琼脂pH=5.8幼株生根壮苗MS+10%香蕉+2.0mg/LNAA+3%蔗糖+0.8%琼脂pH=5.4-5.6配制（以1000ml幼株生根壮苗培养基为例）10%香蕉（w/w）+MS+3%蔗糖（w/w）+0.8%琼脂（w/w）+2.0mg/LNAA1）量取800ml蒸馏水于干净大烧杯中，加热至沸腾；2）精确称量100g香蕉果肉，切成碎片状，并倒入上述烧杯中，加热煮沸5min，其间搅拌使之充分溶解；3）按照大量、微量、Fe2+盐、有机Ⅰ、有机Ⅱ顺序，量取MS各种母液于盛有50ml蒸馏水烧杯，混合均匀；4）将2）和3）溶液混合，然后加入30g蔗糖，并移取2mlNAA（0.1mg/ml），混合均匀；5）加热至沸腾，加入8g琼脂并煮沸5min，其间不断搅拌使之充分溶解；6）冷却至50±5℃时，调pH至5.4—5.6。分装于培养瓶内，33.3ml/瓶。注意事项：①溶解香蕉蒸馏水尽量多，以保证香蕉各种成分完全溶解；②各种母液混合时，要按照大量、微量、Fe2+盐、有机Ⅰ、有机Ⅱ顺序；③煮沸时，小心溶液溢出；④分装时不要污染培养瓶瓶口。灭菌：1）检查灭菌锅水位、电源、排气阀、排气管、安全阀以及压力表，保证灭菌锅各指标和功能正常，以防事故发生；2）把带灭菌培养基装入锅内，盖上锅盖，对称而均匀地扭紧螺丝；3）打开电源和排气阀，调节电压至220V；4）待排气阀排除水蒸气30s—1min后，关闭排气阀；5）当温度上升到121℃后，调节电压至135V，保持20min；6）关闭电源，使之自动降温至0℃。10min后，打开排气阀和锅盖；7）5—10min后，取出培养基放于实验台上冷却，待用。表2灭菌时间记录阶段单锅灭菌（耗时64min）多锅持续灭菌第一锅（耗时63min）第二锅（耗时46min）起始22:218:049:30排气22:418:239:43T=121℃22:508:329:50关闭电源23:108:5210:10气压降至023:259:0710:16注意事项：①启动灭菌前，应检查水位、电源、排气阀、安全阀、排气管等，保证正常；②灭菌锅底部应铺垫一层报纸，以防培养瓶机械破损；③灭菌电压不适当超过220V，否则灭菌锅会激烈摇晃，导致不必要损害和安全隐患；④当温度达到121℃后，调节电压至135V，并且时不时注意温度变化，保证温度介于121-122℃之间；⑤气压降至0后，不适当及时揭盖；最佳在5-10min后揭盖，这样才干缓和内外“气压和温度差”；⑥揭盖5-10min后，再转移锅内培养基，以免烫伤。⑦每锅只能灭菌18瓶转接转接前准备1）培养皿、镊子、剪刀等转接用品灭菌（可以在培养基灭菌时附带）；2）检查超净台内各种用品，及时补充酒精灯酒精，保证用品齐全；3）放置待转接材料和待接入培养基，以“以便操作为宜”而陈列；转接1）揭去防尘膜，打开电源、通风和紫外灯，灭菌15—20min；2）关掉紫外，打开白炽灯，用75%酒精仔细擦拭手指、指甲、材料瓶瓶盖及盖边沿、工作区等处，保证“消毒”彻底；3）点燃酒精灯，用无菌镊子把材料夹取于无菌培养皿内，挑选生命力旺盛植株用于转接；4）用无菌剪刀修去多余根系，“双镊子”法将材料转接于新培养基中；5）标注有关日期和品系，转至培养室培养。注意事项①操作时，所有用品均不能从“核心工作区”和启动培养瓶上面晃过，防止细菌落入而导致污染；②在打开材料瓶和培养瓶后，其盖均在酒精灯外焰灼烧3-5s，瓶口灼烧5-10s；盖瓶盖时，亦如此操作；③转接时，保证手始终在超净台内，以免带入外界细菌。培养：培养条件：白炽灯12h/黑暗12h＋20℃PDA培养基配制办法，培养基湿热灭菌操作一、目规定1．学习并掌握配制培养基普通办法和环节。2．学习并掌握棉塞制作办法。二、培养基配制原理培养基是人工配制各种营养物质供微生物生长繁殖基质，用以培养、分离、鉴定、保存各种微生物或积累代谢产物。在自然界中，微生物种类繁多，营养类型多样，加上实训和研究目不同，因此培养基种类诸多，但无论是何种培养基，均应具有水分、碳源、氮源、能源、无机盐等。不同微生物对pH值规定不同样，因此配制培养基时，还应依照不同微生物对pH值规定，将培养基调到适当p