菜籽多糖的提取、分离、结构及生物活性的研究.doc

菜籽多糖的提取、分离、结构及生物活性的研究近十多年来，多糖因其具有复杂的、多方面的生物活性和功能引起了生物学家、药理学家和化学家的极大兴趣。有关专家曾预言：“21世纪是多糖的时代”。为了提高菜籽饼粕的综合利用率，开展菜籽饼粕中多糖的研究很有必要。然而，目前国内外对于菜籽多糖的研究报道尚不多见。本文以菜籽饼粕为原料，对菜籽饼粕中的多糖的提取工艺、分离纯化、结构特征进行了研究，并考察了碱提菜籽多糖的抗氧化和抗肿瘤生物活性，主要研究内容如下：1菜籽（饼粕）中Pb、Cd含量测定及饼粕成分分析建立了微波消解-石墨炉原子吸收同时测定菜籽及饼粕中有害重金属Pb、Cd含量的新方法，在最佳条件下，测得华杂四号双低菜籽及脱脂粕中的重金属铅含量分别为1.609和0.663μg·g^-1，重金属镉含量分别为0.077和0.044μg·g^-1。按照国家标准测定华杂四号双低菜籽的含油量、蛋白质、水分、灰分、粗纤维含量，分别为45.32％、23.35％、6.02％、4.37％、5.08％；华杂四号双低菜籽脱脂粕的含油量、蛋白质、水分、灰分、粗纤维含量分别为0.36％、38.53％、9.21％、7.05％、20.24％。与普通菜籽相比，华杂四号双低菜籽含油量有所增加，蛋白质和粗纤维含量较低。2菜籽饼粕中多糖的提取方法比较菜籽饼粕经脱脂、脱色后，分别采用NH₄Cl、超声辅助水、超声辅助HCl和超声辅助NaOH等几种方法提取，乙醇沉淀，可以得到菜籽多糖。在单因素实验的基础上，采用正交试验对菜籽多糖几种提取工艺进行比较研究，结果表明：采用超声辅助碱提取可以在较低的温度下，用较短的时间提取出多糖，其最佳提取条件为：浸提液NaOH浓度1.0mol·L^-1，提取温度80℃，料液比1：20，提取时间为30min，提取得到的菜籽多糖的含量为8.87％。采用超声辅助碱提取更利于菜籽饼粕中多糖的提取。进一步采用五元二次旋转正交试验对超声辅助碱提的条件进行优化，得到14个组合的多糖含量超过12％，其中在NaOH浓度为1.4mol·L^-1，料液比1：30，80℃提取5次，每次50min时，提取率最大，可以达到16.25％。3碱提菜籽多糖的分离、纯化及理化性质分析碱提菜籽多糖经过Sevag法脱蛋白5次后，可以得到脱除大部分游离蛋白的粗多糖。粗多糖过DEAE-SephadexA-25柱，经0-1.0mol·L^-1NaCl洗脱，分别得到四个级分多糖，分别命名为RSPS-1、RSPS-2、RSPS-3和RSPS-4，其得率分别为11.2％、56.92％、16.68％、15.20％，其中，RSPS-1和RSPS-4两个级分的量比较少。经过SeohadexG-100柱进一步分离，结果表明，RSPS-2和RSPS-3较为纯净，仍为一个单一级分；而RSPS-1和RSPS-4分别得到两个亚级分。对其理化性质分析表明，四个级分多糖都是糖蛋白缀合物，经测定，其中RSPS-2中性糖含量为32.47％，葡萄糖醛酸含量为34.55％，蛋白质含量为32.54％：RSPS-3中性糖含量为12.29％，葡萄糖醛酸含量为55.47％，蛋白质含量为27.52％；它们都含有很高的糖醛酸，不含有淀粉多糖、还原糖和多酚类物质。4碱提菜籽多糖的结构表征采用凝胶渗透色谱法对级分多糖RSPS-2和RSPS-3进行了分子量测定。结果表明，RSPS-2的数均分子量Mn为4.434×10⁵，重均分子量Mw为7.187×10⁵，多分散系数Mw／Mn为1.621，而RSPS-3的数均分子量Mn为1.157×10⁶，重均分子量Mw为1.226×10⁶，多分散系数Mw／Mn为1.059。采用紫外和红外光谱分析考察其结构，表明，菜籽多糖RSPS-2、RSPS-3、RSPS-1a和RSPS-4a都是含有蛋白质的糖蛋白缀合物。核磁共振波谱分析证明RSPS-2和RSPS-3都含有α-糖苷键，RSPS-2中还存在β-糖苷键。氨基酸自动分析仪检测两个级分多糖的氨基酸组成和经β-消除反应后的氨基酸组成变化，结果表明，RSPS-2中的结合蛋白主要含有谷氨酸、苏氨酸、缬氨酸、胱氨酸等12种氨基酸；而RSPS-3中的结合蛋白主要含有谷氨酸、缬氨酸、胱氨酸等13种氨基酸；经β-消除反应后的氨基酸分析显示，RSPS-2的丝氨酸和苏氨酸的量明显减少，苯丙氨酸含量明显增加，其它氨基酸含量基本保持不变，可见RSPS-2级分多糖含有O-糖苷键；而RSPS-3的丝氨酸和苏氨酸含量基本不变，由此可推断RSPS-3级分多糖含有N-糖苷键。采用柱前衍生化-高效液相色谱法