几丁质脱乙酰酶产生菌的诱变育种及产酶条件研究.doc

几丁质脱乙酰酶产生菌的诱变育种及产酶条件研究壳聚糖,几丁质的脱乙酰基产物,具有比几丁质更好的溶解性、可降解性和生物相容性。壳聚糖有抑菌、保湿、调节血脂等优良性能,因而在食品、医药等领域有很大的开发和应用潜力。几丁质脱乙酰酶(CDA),是酶法制备壳聚糖的关键酶。该方法制备壳聚糖反应条件温和、能耗值低、环境友好,是行业未来的发展趋势。本研究以海口红树林土壤中筛选出的一株产CDA丝状真菌PenicilliumjanthinellumUV-OS为出发菌株,采用多级紫外诱变方法进行诱变育种,针对筛选获得的高产诱变菌株的培养基配方和发酵条件进行了优化,最后对胞外CDA粗酶的酶学性质进行了研究,主要内容和结果如下:1.紫外线诱变育种以PenicilliumjanthinellumUV-OS为出发菌株,对其孢子液进行紫外线诱变处理,经多级紫外诱变后获得一株高产CDA诱变菌株UV-3S。UV-3S的胞外CDA酶活值为11.05U/mL,是原始株UV-OS的2.13倍。2.诱变菌株UV-3S与野生菌株UV-OS的发酵产酶特性诱变菌株UV-3S与野生菌株UV-0S培养24h后,每12h分别测定它们的胞外CDA酶活、胞内CDA酶活、残糖量、生物量。观察生物量与胞外CDA合成过程曲线,发现两株菌的菌丝体生长与胞外CDA的分泌呈现耦合关系;胞外CDA酶活均显著高于胞内CDA酶活,且于发酵72h时达到最高;不同的是UV-3S在发酵后期,胞外CDA酶活值下降速率更快。3.细胞壁几丁质的脱乙酰度(DD)变化通过傅里叶红外光谱仪测定发酵42h、72h、96h的Peniciliumjanthinellum细胞壁几丁质,发现UV-3S的细胞壁几丁质的DD值分别为74.04%、76.33%、79.62%。UV-0S的细胞壁几丁质的DD值分别为80.05%、84.01%、90.52%。4.诱变菌株UV-3S发酵培养基配方及发酵条件优化通过单因素试验和正交试验得出该诱变菌株的最佳培养基配方为麦芽糖1.3%,牛肉浸膏2.2%,NaH2PO40.2%,CaC120.07%,胶体几丁质0.5%;最佳发酵条件为NaCl1.5%,初始pH9.0,发酵温度30℃,装液量20%(v/v),接种量2%(v/v),摇床转速180r/min。经发酵优化后该诱变菌株的最高胞外CDA酶活值为19.62U/mL,相比优化前的酶活提高了78%。5.胞外CDA粗酶的酶学性质研究预先将粗酶液分别置于40℃、50℃、60℃、70℃、80℃恒温水浴保持1h,取出后于50℃测定残留酶活,考察酶的热稳定性。预先将粗酶液置于pH4、5、6、7、8、9缓冲液中处理1h,考察酶的酸碱稳定性。试验表明该胞外CDA的最适pH为7,且在pH6-8范围内,胞外CDA相对酶活达到80%。该胞外CDA的最适温度为50℃,在40-60℃范围内,相对酶活达到80%。Na+、Ca2+对胞外CDA酶活具有激活作用,Cu2+、Fe3+对胞外CDA酶活有抑制作用。