利用RNA干扰技术沉默稻纵卷叶螟几丁质合成酶B基因.doc

利用RNA干扰技术沉默稻纵卷叶螟几丁质合成酶B基因世界上有大半以上的人口将稻米作为主食,水稻作为全球最主要的粮食和经济作物之一,病虫害的防治一直以来都是一件至关重要的事情。稻纵卷叶螟(Cnaphalocrocismedinalis)主要以包括水稻在内的众多禾本科植物叶片为食,因此也是对此类农作物危险相当严重的害虫之一。几丁质合成酶(chitinsynthase)是昆虫体内几丁质合成通路上至关重要的一个酶,在昆虫生长发育周期中扮演着十分重要的角色,因此这个酶也常被科研工作者作为研究对象。本论文的主要目的是通过RT-PCR结合RACE技术克隆并分析稻纵卷叶螟几丁质合成酶B基因(CmCHSB)的全长cDNA序列。再利用植物转基因RNAi技术,获得对CmCHSB具有明显抗虫效果的转基因水稻植株。通过稻纵卷叶螟取食这种转基因植株后的发育障碍和致死效应,从而达到利用安全有效的生物防治方法来防治稻纵卷叶螟。本研究的主要研究结果如下:1.稻纵卷叶螟几丁质合成酶B基因的克隆及表达谱本研究起初运用RT-PCR方法扩增出稻纵卷叶螟开放阅读框部分片段,然后再利用RACE-PCR技术扩增出CmCHSB的全长cDNA。然后将这两部分所获得的序列片段拼接得到稻纵卷叶螟几丁质合成酶B基因全长4878bp,开放阅读框长4578bp,共编码1525个氨基酸。利用相关在线软件对该酶进行生物信息学分析,结果发现该酶有17个跨膜结构域,理论等电点为5.89,无信号肽。三级空间结构分析与同源建模结果显示,CmCHSB的三维分子空间结构中含6相同数量的α螺旋和β折叠片,均为6个,没有发现标签序列的存在。氨基酸序列同源性分析结果表明,CmCHSB的氨基酸序列与亚洲玉米螟(Ostriniafurnacalis)CHSB的氨基酸序列一致性有78%,跟其他昆虫相比同源性是最高的;与烟草天蛾(Manducasexta)和棉铃虫(Helicoverpaarmigera)CHSB的氨基酸序列一致性都达到了73%;与其他在NCBI上已经公布多种鳞翅目昆虫CHSB的氨基酸序列一致性均保持在69%以上。基因的时空表达分析结果显示,CmCHSB在稻纵卷叶螟整个生长发育时期以及成虫各个组织中均发现有表达,卵期和头部表达极低,几乎检测不到,成虫时期和成虫中肠表达最高,其表达模式高低呈现一定的规律性。2.注射dsRNA干扰稻纵卷叶螟几丁质合成酶B基因的表达根据CmCHSB的全长cDNA序列,设计一个相应的靶标点,将其命名为CmCHSB,利用试剂盒在体外合成该基因的dsRNA。用体外显微注射法导入正常饲养的3龄健康且活性强的幼虫体内,以相同的方法设计维多利亚多管发光水母(Aequoreavictoria)绿色荧光蛋白(GFP)的靶标点和空白作为对照。采用体外显微注射法将合成的dsRNA导入幼虫体内进行饲养,通过不同处理组稻纵卷叶螟对水稻叶片额取食和取食后表型观察结合实时荧光定量PCR(RT-qPCR)技术检测稻纵卷叶螟体mRNA表达量探索RNA干扰效应。在分别注射CmCHSB与GFP的dsRNA48h和72h后,空白组和GFP组水稻叶片被稻纵卷叶螟取食的白条数明显多于实验组(注射dsRNA),两个对照之间的白条数却没有明显的差异;随着时间的推移,两个对照被稻纵卷叶螟取食越来越严重,而实验组的取食情况变化不显著。实验结果显示,在对稻纵卷叶螟进行注射实验以后,其活性及生长发育受到很严重的抑制作用。在进行注射处理7d后,取出直管中存活的稻纵卷叶螟提取RNA后进行实时荧光定量检测。RT-qPCR结果显示,在注射dsRNA7d以后,对比于GFP和空白两个对照,CmCHSB分别下降了18.11%和37.83%。3.重组RNA干扰植物表达载体的构建与鉴定根据稻纵卷叶螟几丁质合成酶B基因的全长cDNA序列设计一个400bp大小的靶位点,分别将BamHI和SpeI两个酶切位点添加到该靶标位点两端,然后进行人工合成,经双酶切后验证正确后,将其与植物表达载体p1301进行连接,构建p1301-CmCHSB*重组植物表达载体。将构建的重组表达载体经PCR、双酶切和测序鉴定,鉴定结果表明已成功构建好重组表达载体p1301-CmCHSB*,将构建好的植物表达载体采用液氮冻融法转入农杆菌EHA105,以此构建基因工程菌。4.转基因水稻的获得及室内检测用之前构建成功的农杆菌EHA105去浸染蜀恢527号籼稻愈伤组织,经愈伤组织的抗性筛选、分化和植株再生等一系列步骤,成功获得了10株转基因再生植株。由于种植期间某些原因,转仅有植株存活8株。通过对靶标位点进行RTPCR检测,结果表明,存活的8株转基因植株都是是含有CmCHSB*的阳性植株。