肠道菌群通过胆碱能抗炎通路对脓毒症相关性脑病的作用及机制研究.doc

肠道菌群通过胆碱能抗炎通路对脓毒症相关性脑病的作用及机制研究脓毒症是由微生物感染导致宿主炎症反应失衡而造成的器官功能障碍。在我国随着人口老龄化加剧、慢性病增多,脓毒症的发病率不断上升。脓毒症相关性脑病(Sepsis-associatedencephalopathy,SAE)是脓毒症最常见的并发症,由脑以外其他部位感染引起的继发性脑功能损伤,其临床表现为急剧恶化的精神状态,如谵妄、抑郁、甚至昏迷。大量临床研究表明,SAE导致脓毒症患者死亡率增加,即使幸存的患者,因脑功能损伤,仍可长期存在认知功能和情感障碍等,使患者无法回归正常的生活及工作,增加家庭和社会的负担。因此研究如何预防、改善、治疗脓毒症相关性脑病有重要的社会意义。有研究表明,肠道菌群可通过调控神经系统的生长发育、凋亡、免疫、代谢、血脑屏障等影响脑功能。胆碱能抗炎通路是肠道菌群对脑功能产生影响的重要途径之一,即菌-肠-脑轴。胆碱能抗炎通路在外周组织及中枢神经系统中有重要的调节炎症反应的作用,中枢胆碱系统的功能与大脑觉醒、学习记忆、睡眠、感觉运动等高级功能密切相关。过度炎症反应是发生SAE的机制之一,现有研究表明电刺激胆碱能神经可通过抑制炎症反应,降低脓毒症相关性脑病的发生。肠道菌群是否通过迷走神经影响脓毒症相关性脑病,目前尚无相关研究。同时,迷走神经对脑功能产生影响的分子机制,目前亦不清楚。研究表明,SIRT6蛋白可通过对组蛋白和非组蛋白去乙酰化而发挥调控炎症反应的作用。SIRT6在人和鼠的多种组织中都有表达,尤其是在脑海马组织有较高表达。研究证实,阿兹海默症患者血液样本中SIRT6含量明显减少,炎症介质TNF-α等表达增加,影响患者的认知能力和身体机能。另有研究表明,在其它由慢性炎症反应引起的神经退化性疾病中,SIRT6蛋白含量也明显减少。胆碱能抗炎通路可能通过NF-κB信号通路影响炎症介质的释放。SIRT6与胆碱能抗炎通路均可通过NF-κB途径调控炎症反应,二者在由炎症反应引起的脑病中均发挥重要作用。而胆碱能抗炎通路是否可通过调节海马组织中SIRT6水平影响SAE,需要进一步研究。因此,了解脓毒症患者肠道菌群特征性改变,探讨肠道菌群对脓毒症相关性脑病的作用途径及机制,对脓毒症相关性脑病的研究具有重要的意义。本研究通过构建大鼠脓毒症相关性脑病动物模型,采用16SrDNA高通量测序技术、行为学评分、水迷宫实验、Westernblot、免疫组化等方法,了解脓毒症大鼠的肠道菌群特征及其对脑功能的影响,探讨胆碱能抗炎通路是否为肠道菌群影响脓毒症相关性脑病的主要通路,明确胆碱能抗炎通路是否可通过调节海马组织中SIRT6水平影响SAE,从而为SAE的诊疗提供理论依据。第一部分脓毒症患者及大鼠的肠道菌群特征及其对脑功能的影响目的探讨脓毒症患者及大鼠的肠道菌群变化及其对脓毒症相关性脑病的影响。方法1.采用前瞻性对照研究的方法,选取2016.6-2017.10就诊于河北省人民医院急诊科的72例脓毒症患者,根据有无脓毒症相关性脑病,分为脓毒症相关性脑病组(SAE组),脓毒症无脑病组(SEP组),健康10人为对照组(CON组),2组患者均于诊断后7d采集粪便标本,对照组随机留取粪便标本。采用16SrDNA高通量基因测序技术分析3组脓毒症患者肠道菌群的特点;记录并分析脑电图结果。2.将成年雄性SD大鼠随机分为对照组(CON组)、脓毒症模型组(LPS组)。根据大鼠的行为学、脑电图、体感诱发电位将模型组又分为单纯脓毒症组(SEP)和脓毒症相关性脑病组(SAE组)。3组(CON组、SEP组、SAE组)大鼠于制模后7d采集大鼠的粪便标本,采用16SrDNA高通量基因测序技术分析脓毒症大鼠肠道菌群的特点;记录并分析大鼠的脑电图及水迷宫实验结果;采用ELISA法检测大鼠海马组织中炎症因子(TNF-α、IL-6、IL-10)的表达;HE染色观察海马组织结构。结果1.脓毒症患者结果:1.1肠道菌群的比较:(1)SAE组大鼠肠道菌群α多样性指数较CON组降低(P<0.05);(2)基于属水平比较:SAE患者肠道内另枝菌属(Alistipes)丰度[CON(2.9±1.3)%vsSEP(5.4±1.8)%vsSAE(3.3±1.7)%,P<0.05)显著升高,而普拉梭菌属(Faecalibacterium)丰度[(CON2.2±1.5)%vsSEP(5.2±1.6)%vsSAE(3.6±1.5)%,P>0.05]显著降低。1.2脑电图比较:与CON组相比,SAE组诊断后7d脑电图δ波百分比明显增加[(17.31±0.72)%vs(10.12±0.49)%],P<0.01。与SAE组比较,SEP组诊断后7d脑电图δ波百分比均明显减少[(12.25±0.14)%vs(17.31±0.72)%]