蜂毒肽@ZIF-8纳米载药体系的构建及抗肿瘤活性研究.doc

蜂毒肽@ZIF-8纳米载药体系的构建及抗肿瘤活性研究天然生物毒素蜂毒肽（Melittin,MLT）为蜂毒的主要成分,是一种由26个氨基酸组成的两亲性多肽,具有广泛的药理作用,如抗炎、抗菌、抗病毒、抗辐射、抗肿瘤等。蜂毒肽在抗肿瘤方面具有独特的优势,它可以直接攻击肿瘤细胞,通过裂解肿瘤细胞膜来增加细胞膜的间隙,破坏磷脂膜的完整性,使得细胞内容物外溢,引起细胞死亡。同时,研究表明蜂毒肽经过胞内递送后还可通过类似的方式作用于胞内细胞器,诱导生化变化或转录调节,它对肿瘤细胞的多种功能均可产生影响,包括抑制增殖、诱导凋亡、抑制转移和血管生成及阻滞细胞周期等,为未来的肿瘤治疗提供了广阔的前景。然而,蜂毒肽强烈的溶血性和非特异性细胞毒性,以及易变性、体内降解快、半衰期短等问题均严重阻碍了其临床应用。因此,如何做到减毒增效,将蜂毒肽有效递送至肿瘤组织,并降低其对正常组织细胞的毒性,对于其临床应用具有重要意义。纳米载药体系能够有效发挥材料对药物的保护作用,协助药物跨越黏膜屏障,通过高通透性和滞留（Enhancedpermeabilityandretention,EPR）效应增强药物在靶点部位的累积,改变药物在体内的分布,减少系统性毒性,目前已成为现代药物研究的重要方向。金属有机框架（Metal–organicframeworks,MOFs）是一种新兴的多孔杂化材料,与传统的纳米材料比较,MOFs具有可调节的组成和拓扑结构、高度有序的孔隙、大的表面积以及优良的物理和化学性质,被广泛用于催化、化学传感、气体吸附等多个领域,尤其在药物装载和输送方面备受关注。沸石咪唑酯骨架-8（Zeoliticimidazolateframeworks-8,ZIF-8）是MOFs材料中最具有代表性的一种,其骨架结构是由金属Zn离子与二甲基咪唑中的N原子相连形成的四面体结构。除了具备MOFs的优势外,ZIF-8还具有更好的载药能力、更高的热稳定性、化学稳定性、良好的生物相容性以及灵敏的pH响应性,它在中性生理条件下结构保持稳定,而在肿瘤组织弱酸性的细胞环境中发生分解,使负载药物在肿瘤部位实现可控、精准释放,满足新型纳米载药体系在载药量、稳定性及药物释放等多方面的要求。利用纳米载体递送的方法被认为是改善蜂毒肽癌症治疗效果的最佳策略之一。因此,本研究选择ZIF-8纳米材料作为蜂毒肽的载体材料构建纳米载药体系,实现其减毒增效治疗。本研究主要包括以下三方面工作:1.蜂毒肽@ZIF-8纳米粒的制备及表征本研究建立了蜂毒肽@ZIF-8纳米粒（MLT@ZIF-8NPs）在水体系中“一锅搅拌法”的绿色制备方法,并通过SEM、TEM、DLS测定等表征手段证实得到的纳米粒为规则的菱形十二面体结构,分散性好,单分散纳米粒的粒径尺寸均在100nm左右;通过PXRD、红外、表面电势测定等方法确定了ZIF-8晶体的成功合成和蜂毒肽的有效载入;通过TGA和BCA蛋白测定法确定MLT@ZIF-8NPs中蜂毒肽的载药量为6.9%,包封率为25.5%;MLT@ZIF-8NPs在不同pH条件下的药物释放实验结果显示,MLT@ZIF-8NPs在中性生理条件（pH7.4）下能够保持稳定,而在模拟肿瘤细胞内部的微酸性环境（pH6.8和5.5）中,药物释放率明显升高,说明ZIF-8材料具备优良的pH敏感性,能够在微酸性的环境中发生崩解,有效释放负载药物;MLT@ZIF-8NPs在室温水溶液和37^oC模拟生理条件下（含有10%FBS的PBS缓冲液）的稳定性测试结果显示,MLT@ZIF-8NPs在这两种溶液中的粒径和聚合物分散指数（PDI）在7天内均保持基本不变,说明MLT@ZIF-8NPs具有良好的尺寸稳定性,这对于纳米粒的储存和实际应用具有重要意义;体外溶血实验结果显示,游离蜂毒肽自身具有很强的溶血性,在8μg/mL的给药浓度下即可引起约90%的溶血,而MLT@ZIF-8NPs负载的蜂毒肽浓度达128μg/mL时,仍然具有较低的溶血活性（8%）,说明利用ZIF-8纳米材料包封的方法能够有效降低蜂毒肽对红细胞的溶血活性,减少其对正常组织细胞的非特异性细胞毒性,提高药物体内递送的安全性。2.蜂毒肽@ZIF-8纳米粒体外抗肿瘤活性评价及机制研究为评价MLT@ZIF-8NPs的体外抗肿瘤作用,本研究采用MTT测定法检测了MLT@ZIF-8NPs对肿瘤细胞增殖活性的影响。结果表明,与游离蜂毒肽相比,装载等量蜂毒肽的MLT@ZIF-8NPs对于两种肿瘤细胞（A549细胞和HeLa细胞）的增殖均显示出更强的抑制作用,其中MLT@ZIF-8NPs和游离蜂毒肽对于A549细胞增殖抑制的IC₅₀值分别为6.7和8.2μg/mL,二者对于HeLa细胞的IC₅₀值分别为4.