翡翠贻贝足丝蛋白的鉴定及其汞、镉抗性和富集行为机制研究.doc

翡翠贻贝足丝蛋白的鉴定及其汞、镉抗性和富集行为机制研究贻贝隶属于软体动物门,是一种常见的海洋双壳贝类,主要生活在有海浪冲击的石礁上。目前,有研究表明贻贝能结合重金属,这可能与贻贝足丝蛋白的极强黏附性能有关。据推测贻贝足丝蛋白的种类在35种以上,但目前发现的足丝蛋白不多,尚有大量未被鉴定。为了探究贻贝足丝蛋白黏附重金属的机理及分子机制,本文以翡翠贻贝为研究对象,构建翡翠贻贝足丝蛋白的转录组和蛋白组数据库。通过转录组分析,组装得到73,571个Unigene,其中37.7%的unigene获得功能注释,通过预测编码蛋白框（CDs）共产生34,298个编码序列。结合转录组数据库以及质谱分析,获得了252个足丝蛋白序列,同源比对紫贻贝的足丝蛋白数据库,在足部组织转录组数据库比对到6个足丝蛋白,但在蛋白组数据库只比对到3个蛋白。挑选了Pvfp6和Antistasinlikeprotein两个足丝蛋白进行分析。Pvfp6半胱氨酸、组氨酸、酪氨酸含量高,推测对重金属有吸附作用,并且Pvfp6具有弹性蛋白酶特异性抑制剂和丝氨酸蛋白酶抑制剂结构域,可保护足丝内其他蛋白免受蛋白酶或者肽酶的降解。另外一个足丝蛋白Antistasinlikeprotein半胱氨酸含量高且存在类似金属硫蛋白cys-x-cys的结构,推测其对重金属也有富集作用。为了验证Antistasinlikeprotein和Pvfp6是否具有黏附重金属能力,利用基因工程技术,将其编码基因克隆至pET-30a,并转至宿主细胞大肠杆菌BL21（DE3）中表达,成功构建了分别包含编码Antistasinlikeprotein和Pvfp6外源基因的重组菌AL1和P6。研究两株重组菌对Hg²⁺、Cd²⁺的抗性和富集能力,结果显示重组菌AL1和P6都具有一定的抗汞、镉能力,其分别能在含Hg²⁺浓度为5mg/L、5mg/L,或者含Cd²⁺浓度为120mg/L、160mg/L的培养基中生长。与原始宿主菌相比,重组菌AL1、P6对Hg²⁺的平衡富集量分别为121.95mg/g、109.89mg/g,均高于对照组的富集量93.46mg/g;但对Cd²⁺的平衡富集量分别为20.92mg/g、19.27mg/g,与原始宿主菌的16.50mg/g相比无明显差异。