粗茎秦艽种子萌发特性及药材质量评价研究.doc

粗茎秦艽种子萌发特性及药材质量评价研究粗茎秦艽GentianacrasicaulisDuthieexBurk.为龙胆科（Gentianaceae）龙胆属（Gentiana）多年生植物。是我国传统中药材之一,主要分布于西藏东南部、云南、四川、贵州西北部、青海东南部、甘肃南部等海拔2100⁴500m地区,在四川和云南有栽培品。粗茎秦艽以野生资源为主,有较高的药用价值。据现代研究表明,该植物活性物质为环烯醚萜苷、黄酮和三萜等成分,醇提物具有抗炎、镇痛、抗菌作用,水提物有保肝、降压、心血管保护等作用。但是粗茎秦艽以有性繁殖为主,近年来临床用药量增加,过度采挖导致野生资源日渐枯竭,已被列为北京II级保护野生品种,迫切的需要开展人工栽培来缓解资源紧缺。通过前期采样检测,高海拔产地（四川省阿坝州黑水县）粗茎秦艽药材马钱苷酸和龙胆苦苷含量高,为《中国药典》（2015年版）含量测定项下检测指标的3⁶倍。而目前,高海拔产地人工栽培遇到的主要问题是粗茎秦艽种子具有休眠期不定和高海拔生长缓慢,一定程度上影响了粗茎秦艽的资源栽培和临床安全、有效的用药。因此,本课题对粗茎秦艽种子破除休眠、最适生长条件、种子萌发RNA-seq、产地动态温度、动态含量和高分辨质谱定性进行了试验研究,以期为粗茎秦艽药材人工栽培、药效评价、质量标准及进一步开发应用奠定基础。1.以萌发率为评价指标对粗茎秦艽种子浸泡处理破除休眠试验。试验结果表明:将种子30℃流水浸泡12h、1.5%KMnO₄浸泡10min,流水冲干净,经500mg/LGA3浸泡12h,置于25℃有光照的恒温培养箱,粗茎秦艽种子萌发率为最高。2.采用单因素试验法,以新芽从萌发长到1cm生长率为评价指标对不同温度、光照强度、光照时间进行生长条件筛选试验。试验结果表明:粗茎秦艽萌发新芽在25℃温度、3000Lux光照强度、12h/d光照时间生长条件下,新芽生长最快,长势最好。3.基于RNA-seq二代测序技术,对粗茎秦艽种子萌发过程中基因表达影响激素调控机制初步试验。试验结果表明:粗茎秦艽萌发过程三个阶段共有差异基因386条;光合作用途径下差异基因41个、植物激素转录信号途径下差异基因71个、淀粉和蔗糖代谢途径下差异基因88个、苯丙素生物合成途径下差异基因66个。4.运用DS1921G温度自动记录仪,采集黑水县5个不同海拔产地粗茎秦艽根部动态温度试验。试验结果表明:年平均温度与海拔呈负相关关系;日最高温度、日最低温度和日平均温度的变化趋势为先上升,到8月后呈下降趋势;每日最低温度为9:00时,最高温度为18:00时;在5月和9月日平均温度和年平均温度相当,在5⁸月日平均温度高于年平均温度,在9¹1月年平均泽高于日平均温度。5.采用UPLC-Q-ExactiveMS四级杆-静电场轨道阱高分辨质谱联用技术建立快速定性识别和鉴定粗茎秦艽根中化学成分的方法试验。试验结果表明:快速定性识别和鉴定了粗茎秦艽根中34个化合物,包括13个环烯醚萜成分、5个黄酮类成分、5个酯类成分、3个三萜类成分、2个有机酸类成分、1个苯丙素类和5个其他成分,其中有15个化学成分为首次从粗茎秦艽根中研究发现。6.采用HPLC法建立粗茎秦艽根中次生代谢产物动态含量变化的方法试验。试验结果表明:黑水县粗茎秦艽药材含量为《中国药典》（2015年版）含量测定指标下限的3⁶倍;次生代谢产物马钱苷酸含量每月累积上升,而龙胆苦苷、獐牙菜苦苷和獐牙菜苷的动态含量总体呈先下降,到9月后缓慢回升的变化趋势。