粟酒裂殖酵母中Mpa1定位及功能的研究.doc

粟酒裂殖酵母中Mpa1定位及功能的研究线粒体是真核生物进行氧化代谢,糖类、脂肪和氨基酸最终氧化释放能量的场所,为细胞的生命活动提供能量,是细胞氧化磷酸化和形成ATP的主要场所,有细胞“动力工厂”之称。另外,线粒体有自身的DNA和遗传体系,但基因组的基因数量有限,因此,线粒体只是一种半自主性的细胞器。线粒体的表达障碍直接导致各种各样的疾病,如何治疗线粒体疾病成为目前的研究重点。许多研究表明,线粒体功能异常与帕金森氏症、阿尔兹海默病、糖尿病、肿瘤的发生发展过程密切相关,既是疾病病因之一,又是疾病发病的早期征兆。因此研究线粒体基因表达机制,可以为治疗线粒体基础疾病提供帮助。Mpal是我们实验室通过串联亲和纯化(Tandemaffinitypurification)、免疫共沉淀和质谱(massspectrometry)鉴定技术,发现的与Ppr10有体内相互作用的蛋白。mpa1是未被研究过的一个新颖的基因,因而本研究选择mpa1基因作为研究对象。接下来,本研究将对Mpa1的相关功能做进一步研究。借助在线工具MitoProtⅡ(https://ihg.gsf.de/ihg/mitoprot.html)分析结果得知,Pprl0含有线粒体的定位信号肽,但是无法预测到Mpa1的线粒体定位信号肽。由于Mpa1与Ppr10蛋白存在体内相互作用,猜测Mpa1与Ppr10共定位。为了进一步明确Mpa1的定位,对Mpa1做了亚细胞定位,最终确定Mpa1定位于线粒体基质。为了研究Mpa1的相关功能,首先以单倍体酵母菌株yHL6381为出发菌株构建了mpa1基因缺失突变株。接下来,针对突变株进行了一系列的表型研究：包括生长曲线测定,细胞形态观察,不同生长阶段的存活能力、在基础培养基和非发酵性培养基上的生长状况及对线粒体呼吸链抑制剂抗霉素A的敏感性研究。表型研究结果表明,mpa1基因缺失突变株在与呼吸功能相关的培养基上呈现出生长缺陷,并且在生长阶段后期生存能力严重受损。总的来说Ampa1是线粒体呼吸缺陷菌株。同时,WesternBlot技术进一步分析得出,mpal的缺失导致线粒体相关蛋白的合成量降低。最后本实验成功构建了△mpa1/pJK148-1500-mpa1-3HA菌株,且可以正常表达Mpa1蛋白。点圈实验证明菌株可以弥补mpa1基因缺失突变株在非发酵培养基上的生长缺陷,同时WesternBlot证明回补菌株可以恢复线粒体蛋白的合成。由此可知,mpa1的自身调控序列在5’-UTR上游1500bp范围内,并验证了mpa1是非必需基因。在此基础上,对缺失特定区域的Mpa1结构的研究。无论缺失哪部分区域,都可以正常表达Mpa1,但都不能弥补可以弥补mpa1基因缺失突变株在非发酵培养基上的生长缺陷,推测Mpa1在结构完整的情况下才能发挥功能。