海洋链霉菌抗补体活性菌株筛选及活性产物研究.doc

海洋链霉菌抗补体活性菌株筛选及活性产物研究补体系统是人体非常重要的免疫防御系统之一,其在消除微生物入侵和维持机体的平衡等生理过程中起着重要作用。但是,补体系统如果过度激活会引起类风湿性关节炎、老年性痴呆及急性呼吸窘迫综合征等多种疾病。天然产物来源的抗补体活性成分具有可持续生产,且能在体内被直接消化吸收等优点因此引起了国内外学者广泛的关注。由于微生物易于培养、易于基因工程改良,且微生物来源的产品质量容易控制,所以微生物来源的抗补体活性物质具有良好的应用前景。然而,目前对微生物来源抗补体活性物质的研究还非常有限。海洋放线菌次级代谢产物复杂多样,且具有众多生物活性,如抗细菌、抗真菌、抗病毒、细胞毒性和抗肿瘤活性,因此海洋放线菌已成为新药研究与开发的新来源,但目前对海洋放线菌的抗补体活性物质的研究还处于起步阶段。本课题首先筛选了具有抗补体活性的海洋来源链霉菌,并对两株产抗补体活性物质的菌株星海链霉菌StreptomycesxinghaiensisNRRLB24674T(简称S187)和海洋链霉菌Streptomycessp.DUT11(简称DUT11)进行了深入研究,得到以下主要结果:(1)对分离自大连星海湾和小平岛海平面以下约10m处的海泥样品中的42株海洋放线菌进行了抗补体活性物质生产菌筛选,发现7株海洋放线菌的发酵液具有良好的抗补体活性。对这7株放线菌进行了16SrRNA基因序列分析,发现这些海洋放线菌分别属于不同的种,提示可产生抗补体活性物质的海洋放线菌菌株有丰富的生物多样性。(2)进一步研究了具有良好抗补体活性的菌株星海链霉菌S187抗补体活性物质的生产,对其抗补体活性次级代谢产物的发酵培养基进行优化,并对抗补体活性物质进行了分离纯化和结构解析。首先,选取7种不同培养基对菌株S187进行了发酵条件优化,确定M12培养基为最佳培养基,并对其发酵条件进行优化,确定最佳发酵条件为:初始pH为7.0,温度为28℃,培养时间为6天。然后,比较了野生菌株S187和抗补体活性消失的突变菌株△sinH-P3的次级代谢物,寻找抗补体活性物质,液相色谱分析发现两个菌株的多个次级代谢物含量存在差别,结合液相质谱质谱联用分析,初步判断了抗补体活性化合物所对应的液相色谱对应峰。最后,通过抗补体活性追踪的方法,对菌株S187发酵提取物粗品进行了分离纯化,采用正相硅胶柱色谱、反相硅胶柱色谱、凝胶柱色谱、薄层层析色谱和高效液相色谱等各种分离纯化的方法,从粗提物中纯化获得4个小分子化合物,经过理化性质、质谱和核磁共振分析(1H-NMR和13C-NMR),并结合文献值对照,最终确定这4个化合物分别为2-吡咯甲酸、对羟基苯甲酸、邻羟基苯甲腈和邻氨基苯甲酸。活性测试表明,这4个化合物均有抗补体活性,其CH50分别为2.0±0.3、0.8±0.1、2.4±0.5和2.5±0.6mmol/L。(3)以可生产抗补体活性物质的海洋链霉菌DUT11为研究对象,对其基因组序列进行分析,分析基因组次级代谢物生物合成基因簇信息,发现存在衣霉素生物合成基因簇。对DUT11的菌丝体和发酵液进行分析,发现均有衣霉素存在,进而通过优化培养基大量发酵获得粗提物,对抗补体活性组分进行薄层层析色谱、正相硅胶柱色谱、反相硅胶柱色谱、凝胶柱色谱、高效液相色谱和重结晶等各种分离纯化的方法,最终获得9个化合物,经过理化性质和高分辨质谱分析,确定了5个化合物的结构,分别是衣霉素I、衣霉素II、衣霉素V、衣霉素VII、衣霉素X,其余4个化合物是经过理化性质和波谱分析(LC-MS、1H-NMR和13C-NMR),并结合文献值对照,确定其结构分别是3-吲哚甲酸、对羟基苯甲酸、2-吡咯甲酸和无活菌素。在抗补体活性测试中除了无活菌素外,其它8个化合物均具有抗补体活性,其中衣霉素X的抗补体活性最好,其CH50为0.041±0.03mg/mL。(4)对海洋链霉菌DUT11的衣霉素及抗补体活性物质发酵生产的最佳条件进行了优化。该菌株在NaCl浓度为10%时可以生长,NaCl浓度为3%时菌株生长最好,衣霉素的产量最大,为30.78mg/L;而NaCl的浓度在0-5%时抗补体活性没有明显的变化。其次,对链霉菌株DUT11进行衣霉素生产培养基优化,确定了M33培养基作为基础培养基。最后,采用了响应面方法对其培养条件进行优化,确定了衣霉素生产的最佳工艺条件为:可溶性淀粉的浓度(A)、黄豆粉的浓度(B)和酵母粉的浓度(C)分别为49.97、24.88和4.15g/L,衣霉素的产量可到达57.03mg/L;而抗补体活性物质生产的最佳工艺条件为A、B和C分别为47.56、18.00和3.92g/L,提示该菌株可产生除衣霉素外的其他抗补体活性物质。本研究通过对抗补体活性物质生产菌的筛选,证明了许多海洋放线菌具有产生抗补体活性物质的潜力