构树DREB转录因子及木质素合成代谢相关基因的克隆及功能分析.doc

构树DREB转录因子及木质素合成代谢相关基因的克隆及功能分析构树(BroussonetiapapyriferaL.)为桑科构树属落叶乔木,广泛分布于我国大部分地区。它是我国重要的经济林木,其树皮纤维品质优良,自古就是造纸的优良原料;而且它的环境适应性强,是迅速绿化荒山、荒滩和盐碱地的理想树种。对构树这些特性的深入研究和开发利用具有非常重要的生产现实意义。为了探讨构树应答环境胁迫的分子机制和木质素合成代谢的规律,本论文开展了抗逆转录因子和木质素代谢相关基因的分离、克隆以及功能分析等工作,为通过转基因技术在分子水平改良构树提供理论依据和技术保障。目前,取得如下的研究进展:1.采用RACE的克隆方法,从构树中克隆到一个DREB类转录因子,将其命名为BpDREB。该基因序列全长为1384bp,编码一个由330个氨基酸组成的蛋白。序列分析表明:BpDREB基因具有DREB转录因子所特有的核定位信号、DNA结合域以及转录激活域;它与其他已知的DREB基因除了在保守的AP2/EREBP结构域处具有很高的同源性外,在其它的区域同源性不高。利用Southern杂交证实该基因是以单拷贝的形式存在于构树基因组DNA中。Northern杂交分析表明BpDREB基因的表达受高盐、干旱环境逆境的诱导,而不受低温胁迫所诱导,并且其表达不依赖于ABA的调控。2.构建两个在酵母中表达的重组载体pAD-BpDREB和pLexABD-BpDREB,通过两个独立的酵母单杂交试验验证构树DREB蛋白的DNA结合域和转录激活域。将这两个融合表达载体分别转入酵母菌株JM4271和酵母菌株EGY48,并分别在SD/-His+10mM3-AT和SD/-Leu-Ura-His的平板上筛选转化子,同时进行显色鉴定以及β-半乳糖苷酶活性的定量测定,从而检测2个报告基因的表达情况。试验结果表明:构树DREB蛋白具有DREB转录因子的两大功能结构域,即DNA结合域与转录激活域,能够特异地识别DRE元件,并能激活下游目标基因的表达。3.构建在植物中正向过量表达的双源表达载体p3301-121-BpDREB,将其转入农杆菌EHA105中。通过沾花法直接转化拟南芥,获得T1代转BpDREB基因植株。用PCR和Gus染色的方法对转基因拟南芥进行了分子检测。并对转基因。