尼古丁调控miR-30a生成影响牙周膜细胞细胞周期和炎性反应机制研究.doc

尼古丁调控miR-30a生成影响牙周膜细胞细胞周期和炎性反应机制研究牙周炎(periodontitis)作为口腔健康的头号杀手,主要由菌斑引起的直接细胞毒作用及宿主对菌斑微生物的免疫应答导致牙周组织损伤,进一步引起牙周支持组织丧失,导致牙齿缺失。越来越多的研究证实在牙周炎发生发展过程中存在多种miRNAs的表达变化,提示它们在牙周炎发生发展中发挥着重要的作用。然而,其究竟通过何种途径来影响牙周炎的发生发展过程,尚需大量研究证实。吸烟作为牙周炎重要的危险因素,烟草中的主要成分尼古丁在牙周炎发生发展过程中发挥着重要作用。课题组前期研究通过构建牙周炎大鼠模型、体外培养人牙周膜细胞,尼古丁作用于实验性牙周炎大鼠和人牙周膜细胞后,发现烟碱型乙酰胆碱受体α7亚型(alpha7nicotinicacetylcholinereceptor,α7nAChR)在实验性牙周炎大鼠牙周组织和和人牙周膜细胞的表达均显著升高,α7nAChR特异性拮抗剂α-银环蛇毒素(α-bungarotoxin,α-BTX)可拮抗该效应,进而参与吸烟相关性牙周炎发生发展过程。另有研究表明,尼古丁、α7nAChR可能通过调控多种miRNAs表达水平,参与多种心血管系统、神经系统疾病的发生发展过程。然而关于尼古丁、α7nAChR调控miRNAs参与牙周疾病乃至口腔疾病发生发展的研究却鲜有报道。由此,我们猜想:尼古丁激活人牙周膜细胞α7nAChR后可能会通过miRNAs进一步参与吸烟促牙周组织炎性损伤和抑制牙周组织修复过程。但是其具体分子机制尚需进一步研究。本研究将深入探讨miRNAs在吸烟相关性牙周炎发生发展中发挥的作用,为牙周炎的防治提供新的理论依据和治疗靶点。【目的】【目的】本课题拟从尼古丁调控牙周膜细胞周期进程、细胞增殖、STAT3信号通路等方面入手,系统探讨尼古丁可能通过调控牙周膜细胞miR-30a表达水平,进而调节NF-κB-miR-30a-STAT3反馈环路和CCNE2参与牙周组织炎性损伤和组织修复过程的机制;探索基于miR-30a调节途径出发降低尼古丁促牙周炎患者的牙周组织损伤和抑制牙周组织修复效应,为有效预防及治疗吸烟相关性牙周炎提供新的理论依据。【方法】1.组织块法进行牙周膜细胞原代培养;在成功培养原代牙周膜细胞后进行常规传代。流式细胞实验鉴定细胞表型;待牙周膜细胞传至第五代时,给予细胞尼古丁处理,microRNA芯片检测尼古丁处理后牙周膜细胞miRNAs表达情况,选取与细胞增殖和炎性反应密切相关的miRNAs进行qPCR验证,考虑到miR-30家族成员成熟形式差异较小,故通过扩增其前体形式来比较表达差异。2.分别给予第5代牙周膜细胞10-5M尼古丁和/或10-8Mα-BTX和/或miR-30ainhibitor处理;MTT实验检测各组细胞增殖情况,流式细胞实验分析各组细胞周期分布情况,实时定量PCR检测各组牙周膜细胞miR-30a表达情况,实时定量PCR和Westernblot实验检测各组细胞CCNE2的mRNA和蛋白表达情况。构建CCNE23’UTR野生型和突变型报告基因载体,双荧光素酶报告基因实验验证miR-30a是否可以直接结合CCNE23’UTR区;设计CCNE2干扰RNA,验证CCNE2在调节牙周膜细胞增殖和细胞周期中的作用。3.分别给予第5代牙周膜细胞10-5M尼古丁和/或10-8Mα-BTX和/或miR-30ainhibitor处理;采用实时定量PCR和Westernblot实验检测各组细胞SOCS3、JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3、IL-1β、IL-6及TNF-α等炎性因子mRNA和蛋白表达情况,双荧光素酶报告基因实验检测尼古丁对STAT3活性水平的影响。构建SOCS33’UTR野生型和突变型报告基因载体,双荧光素酶报告基因实验验证miR-30a是否可以直接结合SOCS33’UTR区;设计SOCS3干扰RNA,验证SOCS3在调节牙周膜细胞JAK2-STAT3信号通路中的作用。4.尼古丁可显著上调pre-miR-30a表达,提示尼古丁对miR-30a的抑制作用可能发生于转录起始水平。因而,我们对miR-30a的潜在宿主基因进行分析,发现miR-30a宿主基因的启动子区存在转录因子NF-κB的结合位点。分别给予第5代牙周膜细胞10-5M尼古丁和/或拮抗剂10-8Mα-BTX和/或5x10-5MPDTC和/或10-6MCucurbitacinI处理;采用实时定量PCR检测各组细胞miR-30a表达水平,Westernblot实验和双荧光素酶报告基因实验检测各组细胞NF-κBp65蛋白表达水平和NF-κB活性水平。【结果】1.体外成功进行人牙周膜细胞原代培养。待细胞聚合生长至90%时,常规进行细胞传代,流式细胞实验发现细胞表