尼古丁对人脐带间质干细胞及肺癌细胞株A549生物学特性影响的研究.doc

尼古丁对人脐带间质干细胞及肺癌细胞株A549生物学特性影响的研究目的:通过实验探讨不同浓度的尼古丁对人脐带间质干细胞(humanumbilicalcordmesenchymalstemcell,hUC-MSC)以及肺癌细胞株A549生物学特性的影响来说明其对人体的潜在危害,以期完善尼古丁、间质干细胞和肿瘤之间的关系,为预防和治疗吸烟相关疾病提供实验依据。方法:(1)采用贴壁法分离培养hUC-MSC,利用形态学特征、成骨成脂多向分化潜能和相关基因表达以及表面抗原标记的检测对其进行鉴定。(2)利用MTT法检测尼古丁对hUC-MSC增殖能力的影响,通过浓度梯度筛选出0.1mg/ml、0.2mg/ml和0.3mg/ml作为后续实验的使用浓度;Transwell实验来检测不同浓度的尼古丁对hUC-MSC迁移能力的影响;流式细胞分析仪检测尼古丁对hUC-MSC周期和凋亡的影响;Westernblot和免疫荧光检测不同浓度的尼古丁对hUC-MSC相关蛋白的表达。(3)用0.3mg/ml的尼古丁预处理hUC-MSC24h后与肺癌细胞株A549共培养24h。(4)通过Transwell实验和划痕实验来检测共培养后的肺癌细胞株A549的迁移能力。(5)用共培养后的肺癌细胞株A549进行裸鼠皮下成瘤实验来评价共培养后的细胞的致瘤能力。(6)对瘤体进行HE染色和免疫组化分析。结果:(1)从脐带组织块中成功分离出一类呈漩涡样生长的长梭形细胞;经过传代纯化后,能够诱导成为成骨和脂肪细胞,并分别表达相应的基因;流式细胞鉴定符合hUC-MSC表面标记。(2)MTT结果表明尼古丁能够抑制hUC-MSC的增殖,并呈浓度和时间依赖性,当尼古丁的浓度在0.1mg/ml到0.3mg/ml之间,不会抑制hUC-MSC的增殖;随着尼古丁浓度的不断增大,hUC-MSC的迁移能力在增强;流式细胞分析显示经过不同浓度的尼古丁处理后的hUC-MSC重阻滞在S期,细胞凋亡数量也随之增加;Westernblot和免疫荧光结果显示E-cadherin蛋白表达降低,N-cadherin、Vimentin、β-catenin等EMT相关蛋白表达均升高,Sox2、Nanog、Sall4、Oct4等干性相关蛋白表达也都有不同程度的升高,CyclinD1、CyclinD3等周期相关蛋白表达也均有升高。(3)Transwell实验和划痕实验显示在共培养的条件下,实验组的肺癌细胞株A549迁移能力比对照组的要强;裸鼠成瘤实验显示实验组细胞成瘤的速度、肿瘤的大小、体积和质量均高于对照组;HE和免疫组化染色显示实验组比对照组的细胞排列更加紊乱、高度异型性、核浆比升高、出现病理性核分裂象以及PCNA表达增强。结论:(1)在体外培养条件下,尼古丁能够增强hUC-MSC的迁移能力和干性。(2)经尼古丁预处理的hUC-MSC与肺癌细胞株A549共培养后,使得A549有更强的迁移能力、恶性程度以及体内致瘤能力。