外泌体介导乳腺癌细胞对多柔比星耐药性的作用及机制.doc

外泌体介导乳腺癌细胞对多柔比星耐药性的作用及机制研究背景及目的乳腺癌是全球女性中最常见的恶性肿瘤之一,同时也是引起女性相关肿瘤死亡的第二大原因。由于早期诊断和先进的治疗策略的改善,乳腺癌的死亡率明显下降。目前乳腺癌的治疗策略通常将手术与多种辅助疗法相结合,如化学疗法,放射疗法,激素疗法,靶向疗法。多数患者在一定时间内对初始治疗有反应,但仍有一部分乳腺癌会发展为更具侵袭性的肿瘤形式,这些形式通常对化疗和放疗有抵抗作用。因此,克服导致预后不良的乳腺癌转移复发是我们目前的主要挑战。近年来随着各种新药上市如内分泌治疗药物、分子靶向药物,乳腺癌在治疗上取得了很大进步,但三阴性乳腺癌治疗和晚期乳腺癌治疗仍以化疗为主。多柔比星在乳腺癌一线化疗中有着重要的作用,但其的广泛应用使越来越多的患者对多柔比星产生了化疗耐药。随着对化疗耐药作用及分子机制的进一步探索,作为基因货物载体的肿瘤细胞来源的外泌体在细胞间耐药信息的转移逐渐引起研究人员的关注。外泌体是大多数细胞分泌的一种直径介于40~100nm之间的小囊泡,其中含有各种活性分子,包括蛋白质、脂类、DNA、RNA。外泌体作为细胞间信号传递的媒介,在肿瘤化疗耐药、侵袭转移及免疫逃逸等方面发挥着重要作用。肿瘤来源或与肿瘤相关的外泌体是参与调控肿瘤耐药的重要介质,其可通过传递ncRNA、蛋白质等生物学分子赋予肿瘤敏感细胞耐药性。本文主要探讨外泌体在乳腺癌细胞多柔比星耐药传递中的作用及初步分子机制,旨在为乳腺癌对多柔比星的耐药机制以及对逆转耐药的治疗策略提供新的思路。方法1.选用乳腺癌亲本细胞株(MCF-7)、多柔比星(doxorubicin)耐药细胞株(MCF-7/Dox)及多柔比星耐药细胞株上清液共培养的敏感细胞株(MCF-7/EXO)为细胞模型2.应用CCK8法检测多柔比星对MCF-7、MCF-7/EXO、MCF-7/Dox细胞增殖活性的影响。3.通过荧光显微镜观察多柔比星对MCF-7、MCF-7/EXO、MCF-7/Dox细胞凋亡的影响。4.应用超速离心法提取MCF-7、MCF-7/EXO、MCF-7/Dox细胞上清液中的外泌体,应用透射电子显微镜、BCA法、DiI标记法检测外泌体的含量,Westernblot法检测外泌体特异分子CD63和Flotillin-1的表达水平。5.应用激光共聚焦显微镜观察MCF-7细胞对MCF-7/Dox细胞来源的外泌体的摄取情况。6.Westernblot检测MCF-7、MCF-7/EXO、MCF-7/Dox细胞中多药耐药蛋白(ATP-bindingcassettesubfamilyBmember1,ABCB1)的表达水平。7.应用SPSS21.0软件进行统计学分析,计量资料采用方差分析,组间两两比较采用LSD-t法,数据以x±s表示,以P<0.05为差异具有统计学意义。结果1.细胞增殖活性检测显示,MCF-7/EXO细胞对多柔比星的半数抑制浓度(IC50)为0.83±0.09μmol·L-1,明显高于MCF-7细胞的IC50值0.15±0.05μmol·L-1(P<0.01),其耐药性提高了5.5倍。2.凋亡检测显示,多柔比星作用后,MCF-7细胞明显发生凋亡(P<0.001),而与耐药细胞上清共培养的MCF-7/EXO细胞凋亡不明显(P>0.05)。3.外泌体定量及特异性标记物检测显示,MCF-7/EXO细胞的外泌体明显多于MCF-7细胞(P<0.05)。4.PKH67示踪标记显示,MCF-7/ADR细胞来源的外泌体可以被MCF-7细胞摄取。5.Westernblot显示,MCF-7/EXO细胞内ABCB1的表达水平明显高于MCF-7。结论1.多柔比星耐药乳腺癌细胞可以分泌大量的外泌体。2.多柔比星耐药乳腺癌细胞上清与乳腺癌敏感细胞共培养后,其上清中富含的外泌体可以被乳腺癌敏感细胞有效摄取。3.多柔比星耐药乳腺癌细胞来源的外泌体可以向乳腺癌敏感细胞传递多柔比星耐药性,其机制可能与外泌体介导的ABCB1蛋白转运有关。