利用特定转录因子的mRNAs诱导小鼠体细胞重编成为多能状态的研究.doc

利用特定转录因子的mRNAs诱导小鼠体细胞重编成为多能状态的研究细胞分化是一个由少数特化细胞变为一个完全分化的细胞类型的发育生物学过程。在多细胞生物的发育过程中,细胞分化使得生物由一个简单的合子变为具有复杂细胞类型和组织的系统。细胞分化过程是一个庞大的基因调控网络,包括一些进化保守的分子过程,比如细胞信号转导,参与调控分化相关基因的开关。尽管目前已有众多关于细胞分化的调节机制的研究,但对于发育过程中细胞分化和特异化的机制尚不明确。为了解决之一问题,将已分化的细胞逆转为多能性细胞,进而探讨细胞的分化机制就显得尤为必要。长时间以来,大部分学者认为细胞在分化过程中会失去不再需要的染色体或永久可灭活的基因,因此这些分化的体细胞命运无法重新编程。但是,细胞融合、体细胞核移植等实验方法以及提取的所有细胞表明细胞的命运可以被逆转并具有胚胎时期的特性,这暗示可溶性的反式作用因子在细胞中的存在,且可以赋予细胞从一个状态转变到另一个状态的能力,通过发现和识别,这些因子被认定主导细胞特化和分化作用。这就表明在细胞分化过程中起重要作用的是可逆的表观遗传变化,而非不可逆的基因变化。对基因重编程的不同理解为进一步探索在发育过程中细胞分化机制提供了新的方法和途径。目前利用体细胞重编程产生多能性细胞已取得很大成就,为进一步了解分化和去分化机制提供帮助,并在科学和医学上领域能够取代ES细胞以克服非伦理限制。此外,细胞重编程获得的多能性细胞在医疗过程避免了免疫排斥的风险,因为它来自于患者自身的细胞。而且,它能够参与到组织工程、再生医学细胞替代疗法和药物开发。目前通过体细胞核移入卵母细胞(SCNT)以及体细胞和多能性细胞进行细胞融合的方法能够使细胞进行重编程而具有多能性。最近通过病毒介导特定转录因子(TFs)异位表达也具有同样的功效。自此,由于病毒介导转基因在操作过程中的危险,以及转基因介导的方法因DNA序列集成的限制可导致原癌基因表达导致恶性肿瘤和不良后果,所以该方法一直在不断的改进。尽管把以非整合DNA为基础的方法如：腺病毒,仙台病毒或空病毒法作为质粒、小环状和非整合型附着载体的使用,DNA的集成问题还是难以避免。故而,通过DNA转染的方式让相关蛋白质和转录因子在细胞中表达使得体外多能性的诱导成为可能。但是,这一方法仍然面临众多问题：成本高,效率低以及无法完全了解转入细胞中蛋白质的具体功能。而且,在非整合重编程获得多能性细胞的过程中发现过表达和microRNAs转染与多能性有关联,但是具体机制尚不明确。最近,科学家使用一种更加安全的重编程方法：通过导入编码重编程因子的mRNA分子进入体细胞(mRNA介导的基因传递)。这种方法在造血干细胞、充质基质细胞、树突状细胞、淋巴细胞和来源于神经元中的星形胶质细胞中使用能够高效的促进蛋白表达；并且成纤维细胞和星形胶质细胞被重编程为心肌细胞。目前这项技术已经证实,在人类体细胞成编程产生多能性性细胞,在转染的体细胞多能性基因被成功激活。依赖相关因子易位表达的重编程与主要的基因,表观遗传修饰相结合能够克服重编程过程中的转录障碍。鉴于利用重编程因子mRNA来诱导小鼠的多能性的相关报道较少,我们在使用mRNA转染方法的基础上,旨在将小鼠成纤维细胞去分化或重编程,逆向回到其多能性特性细胞的发育阶段。为了实现这一目标成果,首先我们克隆与多能性相关的基因或因子的全序列,插入T7启动子下游,构建真核表达载体。其次,包含因子的新型重组载体用于体外合成mRNA,转染至受体成纤维细胞中,目的是重编程具有胚胎干细胞特性,通过特异的形态学、分子和功能分析检测这些重编程获得的细胞的特性。最后,探索重编程机制,通过在重编程过程中跟踪其表达和启动子甲基化变化,我们检测了一些多能性标记的遗传和表观遗传变化以及表观遗传分子的影响。本研究为更好的理解重编程过程调节提供基础,并且有助于发现早期胚胎发育机制。本研究结果包括以下几点：1.根据GnenBank公布的四个多能性转录因子Oct4,Sox2,c-Myc,和Klf4(OSCK)的序列并克隆。从鼠的睾丸、小肠和结肠等组织中反转录(RTPCR)获得OSCK的开放阅读框或编码区(CDS)。结果显示,OSCK的CDS长度分别为1059bp,960bp,1320bp和1452bp。NCBIBLAST测序结果显示,每一个基因都与属的参考序列具有高序列同源,Oct4,Sox2,c-Myc和Klf4分别为100%,100%,100%和99%。这些说明克隆的四个基因序列正确。2.通过体外克隆真核表达载体下游到T7启动子的开放阅读框(ORF)来构建体外转录模板并且在体外转录反应过程中在5’端加帽子,在3’端加poly(A)尾巴。合成的mRNA通过阳离子脂质体转染到小鼠胚胎成纤维细胞中,转染第二天RT-PCR检测到mRNA的高表达。