农杆菌介导柑橘遗传转化体系的优化.doc

农杆菌介导柑橘遗传转化体系的优化农杆菌介导的柑橘遗传转化效率一直不高,为进一步提高柑橘的遗传转化效率,本研究以金柑、糖橙及柠檬实生苗上胚轴节间茎段为试材,比较系统地研究影响其再生及转化效率的各种因素,完善它了们的遗传转化技术体系。同时,在优化遗传转化技术体系的基础上,成功将“外源基因清除系统”(Gene-Deletor)以及“果实无核化”基因导入金柑和糖橙橙中,同时将YFP基因导入柠檬中。主要研究结果如下：1金柑再生及遗传转化技术体系的建立以35d苗龄金柑(完全暗培养)的实生苗上胚轴节间茎段为外植体,水平放置培养于不定芽再生培养基(MS+3mg·L-16-BA)上培养50d左右,不定芽再生率可达到90%；切下不定芽放置于生根培养基(1/2MS+3mg·L-1IBA+1g·L-1AC)上,不定芽生根率可达86%。以35d苗龄(暗培养25d+光照10d)的金柑实生苗上胚轴节间茎段为遗传转化的外植体,用液体共培养培养基(MS+2mg·L-6-BA+1mg·L-1NAA+1mg·L-1KT+20mg·L-1AS,pH=5.4)重悬农杆菌菌液至OD600=0.3后,侵染30min,转入共培养基中,25℃黑暗条件下首尾相连培养3d,再转入筛选培养基(MS+3mg·L-16-BA+50mg·L-1kan+400mg·L-1cef)进行阳性芽的筛选,可获得较高的GUS阳性率。应用以上优化的遗传转化体系,成功将‘’Gene-deletor"和“果实无核化”基因导入金柑细胞中,获得23株转基因株系,转化效率可达6.07%。2糖橙遗传转化技术体系的优化以30d苗龄(暗培养20d+光照10d)的糖橙实生苗上胚轴节间茎段为外植体,在共培养基(MS+3mg·L-16-BA+20mg·L-1AS,pH值5.7)上,19℃C共培养条件下共培养3d后转移到筛选培养基中,最后获得GUS阳性率为29.4%。为便于茎尖嫁接,抗性芽在伸长培养基(MS+0.2mg·L-16-BA+0.2mg·L-1IAA+0.2mg·L-1GA3)上诱导伸长1个月后,95%的抗性芽出现了伸长,平均伸长产度为2.3cm。抗性芽转入生根培养基(1/2MS+0.5mg·L-1NAA+0.1mg·L-1IBA+1g·L-1AC)中培养45d后可获得80.2%的生根率,根系平均长度为5.83cm。应用优化的遗传转化体系,将“果实无核化”基因导入糖橙细胞中,获得的7株转基因株系已嫁接于温室中,目前生长良好。3柠檬遗传转化体系的初步研究参照甜橙的遗传转化体系,以30d苗龄(暗培养20d后光照培养10d)的柠檬实生苗上胚轴节间茎段为外植体,农杆菌侵染时菌液OD600为0.7,侵染15min后将外植体转入共培养基(MS+3mg·L-16-BA+20mg·L-1AS,pH值5.7)上,19℃共培养条件下共培养3d后转移到筛选培养基(MS+0.5mg·L-16-BA+75mg·L-1kan+500mg·L-1cef,或MS+0.5mg·L-16-BA+10mg·L-1Basta+500mg·L-1cef,pH值5.7)中,经检测,成功将YFP基因导入柠檬细胞中,并获得5株YFP阳性芽,YFP阳性率为2.7%。