尼古丁对雷帕霉素诱导痛敏的调节作用及其机制研究.doc

尼古丁对雷帕霉素诱导痛敏的调节作用及其机制研究【研究背景】疼痛是机体内部的一种伤害性感受,可作为人体的防御性保护机制,但同时长期剧烈的疼痛也会给人们带来身体和心理上的折磨。越来越多的人在经历着不同程度的疼痛,长期疼痛会引发各种临床疾病的产生,疼痛在临床上已经成为最常见的病症之一。近年来临床调查发现,患者在服用雷帕霉素后会引发疼痛,但又缺乏很好的治疗办法,给患者带来了很大的困扰。临床上常采用阿片生物碱类作为镇痛药来缓解疼痛,但长期服用镇痛药物,毒性大且易导致成瘾。目前,人们对于尼古丁治疗疼痛的研究已达到了分子和细胞水平,尼古丁镇痛作用强但其抑制疼痛发生的机制尚未得到阐明,因此对尼古丁镇痛机制的研究和探讨一直是近些年神经领域的研究重点,这不仅为治疗疼痛增加了新的途径,而且为发现、设计新的治疗疼痛药物靶点提供了可靠依据。【研究目的】探讨尼古丁在雷帕霉素诱导的小鼠自发性疼痛模型中的镇痛作用及其调节机制,为镇痛药物的研发提供新的靶点和理论依据,为临床上治疗疼痛提供新的研究思路。【研究方法】1.小鼠腹腔注射雷帕霉素诱导痛觉敏感反应的发生,将小鼠分为三组,盐水组、雷帕霉素组和尼古丁组,通过疼痛相关的行为学实验,包括足底机械痛阈值检测、足底热刺痛实验以及甩尾实验检测。观察在急性单次给予小鼠腹腔雷帕霉素注射和连续雷帕霉素注射之后是否可以诱导小鼠痛觉敏感的反应;采用Westernblot和免疫荧光观察与痛觉敏感发生密切相关的ACC脑区(前扣带回皮层脑区)中mTORC1信号通路相关蛋白的表达变化,从而探讨雷帕霉素对mTORC1信号通路产生的作用。2.在给予痛觉过敏的小鼠腹腔注射尼古丁后,行为学观察对尼古丁对小鼠痛觉产生的影响;通过Westernblot和免疫荧光检测ACC脑区中mTORC1信号通路中下游蛋白表达的变化,从而探讨尼古丁通过作用于mTORC1信号通路调节痛阈的相关作用机制;在预先给予小鼠腹腔注射α4β2nAChR拮抗剂DHβE或α7nAChR拮抗剂MLA的情况下,行为学实验观察两个拮抗剂分别对尼古丁抑制雷帕霉素诱导自发痛的影响,阐明尼古丁可能的作用途径。3.通过膜片钳技术检测雷帕霉素对神经元兴奋性的影响,观察指标包括细胞动作电位的变化、第一个动作电位潜伏期,以及观察细胞静息膜电位的变化。在人工脑脊液灌流尼古丁后,实验观察对上述指标产生的影响,阐明尼古丁对神经元兴奋性的作用,进一步验证尼古丁对于雷帕霉素诱发痛敏的抑制作用。【研究结果】1.在给予小鼠腹腔注射雷帕霉素(10mg/kg)后,发现雷帕霉素可诱导小鼠出现痛觉敏感现象产生,具体表现为在足底机械痛检测中雷帕霉素组小鼠的缩腿阈值降低和足底热刺痛检测中小鼠的缩腿潜伏期显著降低,在甩尾实验检测中小鼠的甩尾潜伏期也明显降低;Westernblot和免疫荧光染显示小鼠前扣带回皮层脑区中mTORC1下游分子表达下调,提示雷帕霉素诱导的痛敏可能与抑制mTORC1信号通路有关。2.给予雷帕霉素诱导痛觉过敏的小鼠腹腔注射尼古丁(1.5mg/kg)后,行为学显示尼古丁组小鼠的痛觉过敏行为得到缓解,具体表现为足底机械痛检测中小鼠的缩腿阈值升高和足底热刺痛检测中小鼠缩腿潜伏期升高,以及在甩尾实验中小鼠的甩尾潜伏期也升高;在给予正常小鼠腹腔注射尼古丁(1.5mg/kg)处理后,行为学实验结果显示尼古丁对正常小鼠的痛阈值也有一定影响,具体表现为足底机械痛实验和热刺痛实验中小鼠的缩腿阈值和缩腿潜伏期与对照组比较具有显著性差异。在Westernblot和免疫荧光染色显示尼古丁通过激活mTORC1通路下游底物S6K1负反馈调节作用,增强IRS1磷酸化水平,从而降低了ERK的表达活性,逆转了雷帕霉素对mTORC1信号通路的作用,这可能是其发挥镇痛作用的分子生物学机制;同时尼古丁对正常小鼠ACC脑区中mTORC1相关蛋白表达变化和模型结果趋势一致。3.在预先分别给予小鼠腹腔注射α4β2nAChR拮抗剂DHβE或α7nAChR拮抗剂MLA处理后,发现尼古丁的镇痛作用被其受体亚基的拮抗剂所抑制,提示α4β2和α7nAChR两个受体参与了尼古丁镇痛作用的调节。4.通过细胞膜片钳实验发现雷帕霉素使神经元动作电位发放增加,第一个动作电位出现时间加快,同时也使神经元静息膜电位降低,表明雷帕霉素能够提高ACC区锥体神经元兴奋性。在给予脑片灌流尼古丁后,观察结果发现尼古丁可抑制雷帕霉素诱导的神经元兴奋性升高作用,同时使神经元静息膜电位也相应升高,这说明尼古丁能够抑制雷帕霉素诱导的神经元兴奋性增强,初步阐明尼古丁在这一疼痛模型中发挥镇痛作用的电生理学机制。【研究结论】研究显示尼古丁可能通过激活mTORC1信号通路的负反馈调节,影响IRS1磷酸化水平,导致ERK的活性下降,同时减弱雷帕霉素引起的神经元兴奋性增强,从而缓解雷帕霉素诱导的触摸痛和