尼古丁对血管内皮细胞自噬作用机制的研究.doc

尼古丁对血管内皮细胞自噬作用机制的研究目的:吸烟作为心血管损伤的独立危险因素严重危害人体健康。本实验通过体外研究尼古丁对血管内皮细胞的影响而模拟在体吸烟对心血管损伤的模型,进而探讨尼古丁引起血管内皮细胞的损伤机制,通过明确尼古丁对自噬流及凋亡的影响进而揭示尼古丁与血管内皮细胞功能紊乱之间的关系。方法:用尼古丁干预体外培养的人脐静脉内皮细胞,模拟在体吸烟模型。1.检测尼古丁对血管内皮细胞凋亡和自噬的影响,将HUVECs随机分组:空白对照组、尼古丁组(6×10^-6M)/氯喹组（CQ）和氯喹与尼古丁组（CQ+NIC）,采用蛋白免疫印迹法（WesternBlot）检测凋亡相关蛋白cleavedcaspase-9、cleavedcaspase-8、cleavedcaspase-3及自噬小体标志物LC3Ⅱ和自噬相关蛋白Beclin-1、SQSTM1/p62、LAMP2的蛋白表达水平;采用流式细胞术检测血管内皮细胞凋亡率。2.检测尼古丁抑制自噬的信号通路,将HUVECs随机分为五组:空白对照组、尼古丁组（15min、30min、60min）、α7nAChR基因沉默组（α7nAChRsiRNA+NIC）,采用WesternBlot方法检测AMPKα和ERK1/2、JNK、p38MAPK的磷酸化水平;使用AMPKαsiRNA和ERK1/2/p38MAPK抑制剂后,采用WesternBlot方法检测SQSTM1/p62、LAMP2的蛋白表达水平。3.检测ROS是否抑制自噬流自噬小体的清除,将HUVECs随机分为三组:对照组、尼古丁组（NIC）、α7nAChR基因沉默组（α7nAChRsiRNA+NIC）/ROS清除剂组（NAC+NIC）,采用流式细胞术检测细胞内ROS的生成;采用WesternBlot方法检测细胞内SQSTM1/p62、LAMP2蛋白表达水平。结果:1.尼古丁通过增加cleavedcaspase-8（外源性凋亡途径）和cleavedcaspase-3的活化及细胞凋亡率,进而促进HUVECs凋亡;尼古丁通过减少Beclin-1和LAMP2、增加LC3Ⅱ、SQSTM1/p62的蛋白表达,进而主要抑制自噬流自噬小体清除,使细胞内自噬流受阻。与空白对照组相比,尼古丁处理后cleavedcaspase-9（线粒体凋亡途径）蛋白表达无统计学差异（P>0.05）,cleavedcaspase-8和cleavedcaspase-3蛋白表达都显著增加（P<0.01）,细胞凋亡率也与cleavedcaspase-3有相同的变化趋势（P<0.01）。与空白对照组相比,自噬小体标志物LC3Ⅱ蛋白表达水平在尼古丁处理后增加（P<0.01）。氯喹处理后LC3Ⅱ蛋白表达显著增加（P<0.01）,而氯喹预处理后尼古丁引起的细胞内LC3Ⅱ蛋白表达并没有进一步增加（P>0.05）;尼古丁组中SQSTM1/p62的蛋白表达与LC3Ⅱ蛋白表达变化相一致（P<0.05）,而Beclin-1和LAMP2的蛋白表达水平相比对照组降低（P<0.05）。2.尼古丁通过α7nAChR（尼古丁血管内皮细胞膜受体）激活AMPKα、ERK1/2/p38MAPK信号,但信号的活化并不影响尼古丁对自噬流的抑制作用。与对照组相比,AMPKα和ERK1/2/p38MAPK在尼古丁处理的各时间点都有磷酸化水平的增加,其中AMPKα在尼古丁干预30min时磷酸化水平最高（P<0.01）,而ERK1/2/p38MAPK磷酸化水平最高则出现在尼古丁干预15min时（P<0.01）。用α7nAChRsiRNA处理后,与尼古丁处理30min或15min相比,AMPKα、ERK1/2/p38MAPK磷酸化水平明显下降,而与对照组相比,JNK在60min内磷酸化水平无统计学意义（P>0.05）。与尼古丁组相比,AMPKα基因沉默时SQSTM1/p62和LAMP2蛋白表达无明显变化（P>0.05）。此外,p38MAPK抑制剂SB203580与ERK1/2抑制剂PD98059预处理后SQSTM1/p62和LAMP2蛋白表达水平也无明显变化（P>0.05）;而α7nAChR沉默后,SQSTM1/p62和LAMP2的蛋白表达与尼古丁组相反（P<0.05）。3.尼古丁通过促进HUVECs内ROS生成,进而抑制自噬流自噬小体的清除。与对照组相比,尼古丁组HUVECs内ROS生成显著增加（P<0.01）;沉默α7nAChR后细胞内ROS生成明显减少（P<0.01）。与尼古丁组相比,ROS清除剂（NAC）组SQSTM1/p62蛋白表达水平显著降低（P<0.01）,而LAMP2蛋白表达明显增加（P<0