侵染大蒜12种病毒CP基因的原核表达、抗血清制备及其病毒检测.doc

侵染大蒜12种病毒CP基因的原核表达、抗血清制备及其病毒检测大蒜(A.sativumL.)是我国重要的农作物和经济作物,它的口感非常独特,与众不同,营养价值也很高,在我们的日常生活中常作为佐料来使用,同时在对抗细菌、降低血脂浓度、降低血糖含量,预防癌症发生等多方面有重要功效,除了作为调味品外,在医学研究和应用上也占有重要地位。用鳞茎无性繁殖是大蒜种植普遍采用的方式,经多代多次无性繁殖后病毒的含量会不断积累增加,造成产量和品质逐年下降。大蒜感染病毒后的田间症状多种多样,主要有植株矮化,叶片变黄,并出现不同程度的斑点和皱缩等,还有的感染病毒后不表现任何症状。大蒜病毒病是大蒜生产中最严重的病害,且很难用药物治疗,解决此问题最经济和有效的措施就是培育脱毒或者低毒的种子,确定种子是否带病毒,首先要制备出病毒的抗体,然后选择简便经济高效的方法检测病毒。侵染葱属植物的病毒主要包括三个属的病毒,一是葱属X病毒属(Allexivirus),Allexivirus主要有6种病毒,分别是大蒜A病毒(GarlicvirusA,GarVA)、大蒜B病毒(GarlicvirusB,GarVB)、大蒜C病毒(GarlicvirusC,GarVC)、大蒜D病毒(GarlicvirusD,GarVD)、大蒜E病毒(GarlicvirusE,GarVE)、大蒜X病毒(GarlicvirusX,GarVX);二是马铃薯Y病毒属(Potyvirus),Potyvirus主要有3种病毒,分别是韭葱黄条病毒(Leekyellowstripevirus,LYSV)、洋葱黄矮病毒(Onionyellowdwarfvirus,OYDV)、胡葱黄条病毒(Shallotyellowstripevirus,SYSV);三是香石竹潜隐病毒属(Garlavirus),Garlavirus主要有3种病毒,分别是大蒜潜隐病毒(Garliclatentvirus,GarLV)、大蒜普通潜隐病毒(Garliccommonlatentvirus,GarCLV)、青葱潜隐病毒(Shallotlatentvirus,ShLV)等。从全国各地采集大蒜叶片。根据GenBank报道的序列设计病毒的引物,采用PCR法扩增GarVA、GarVB、GarVC、GarVD、GarVE、GarVX、LYSV、OYDV、SYSV、GarLV、GarCLV、ShLV这12种病毒的CP基因。在T-A连接酶的作用下,将12种病毒的CP基因与表达载体pSBET相连,用碱裂法提取高拷贝的质粒,送到上海生工测定重组质粒的序列。在双酶切的作用下,将CP基因与大肠杆菌BL21(DE3)PlysE表达载体连接,扩大培养含有目的基因的菌株,添加定量的IPTG,诱导CP基因原核表达,12%SDS-PAGE凝胶电泳检测表达结果,实验表明目的基因在大肠杆菌内成功表达。采用两次电泳的方法纯化CP蛋白,先是12%SDS-PAGE,然后是5%-20%SDS-PAGE,将纯化的CP蛋白研磨均匀后免疫小白鼠,就可以获得抗CP血清。蛋白质印迹法检测制得的抗血清,结果显示抗血清特异性都很高,说明均合格,用制得的12种抗血清分别与原核表达的病毒蛋白做Westernblot分析,GarVD和GarVE的CP之间有交叉反应,其他病毒之间无交叉反应。酶联免疫法检测得出,天然病毒粒子的表达蛋白都能与抗血清特异性结合。检测大蒜是否感染12种病毒采用3种方法,分别是蛋白质印迹法、间接ELISA法和Dot-ELISA法。其中,蛋白质印迹法的阳性显示和对照不明显,因此不能用于检测,间接ELISA法和Dot-ELISA法的检测效果都很好,并且实验过程都相对比较简单容易操作,因此可以用于检测大蒜病毒。检测结果为,洋葱黄矮病毒的感染率最高,其次是青葱潜隐病毒,大蒜X病毒,大蒜普通潜隐病毒,胡葱黄条病毒暂未检测出有侵染大蒜的情况。