亚洲玉米螟Ⅲ家族几丁质酶的克隆表达与生化性质表征.doc

亚洲玉米螟Ⅲ家族几丁质酶的克隆表达与生化性质表征几丁质作为其表皮的主要成分,对昆虫的生存至关重要。昆虫体内的几丁质需要不断被合成和降解以满足其生长发育的需要。几丁质酶是几丁质降解过程中的关键酶之一。昆虫几丁质酶分属10个家族,其中Ⅲ家族几丁质酶经预测为膜结合蛋白,并且具有独特的结构域组成,含有两个催化域和一个几丁质结合域。由于该酶的生理重要性已被RNA干扰实验所证实,因此有可能成为绿色农药靶标。然而,该酶在家蚕的蜕皮液中没有发现,其具体生理功能还是未知。本论文以重要农业害虫—亚洲玉米螟Ⅲ家族几丁质酶OfChtⅢ为研究对象,开展克隆表达及酶学性质研究,为阐明其生理功能提供了思路。本论文包括以下研究内容：(1)通过PCR及RACE克隆了亚洲玉米螟Ⅲ家族几丁质酶OfChtⅢ基因,分析其cDNA序列,OfChtⅢ全长4193-bp,其中编码区编码987个氨基酸,N端含有一个长度为23AA的跨膜区域。OfChtⅢ含有两个催化域(CAD),一个几丁质结合域(CBD),进化分析OfChtⅢ属于Ⅲ家族昆虫几丁质酶分支。(2)在毕赤酵母GS115中成功重组表达亚洲玉米螟Ⅲ家族几丁质酶的两个催化域OfChtⅢ-1.OfChtⅢ-2/OfChtⅢ-△2,通过硫酸铵沉淀、金属螯合层析分离纯化OfChtⅢ-2和OfChtⅢ-△2,利用阳离子交换层析分离纯化OfChtⅢ-1。质谱分析证明OfChtⅢ的断裂发生在Arg503和Lys510,导致丢失一段序列为"VKKPTKK"的肽段。(3)酶学性质表征。OfChtⅢ-1.OfChtⅢ-△2和OfChtⅢ-2具有相同的最适pH值6.0。OfChtⅢ-1对4MU-β-(G1cNAc)2底物的亲和力高于OfChtⅢ-Δ2,但催化效率低于OfChtⅢ-△2;OfChtⅢ-1对4MU-β-(GlcNAc)3和乙二醇几丁质的亲和力低于OfChtⅢ-△2,但与OfChtⅢ-△2的催化效率相近。OfChtⅢ-1及OfChtⅢ-△2对于寡糖底物(GlcNAc)n(n=2-6)的催化活性随着聚合度降低而降低,两个催化域都不能水解(G1cNAc)3.OfChtⅢ-1与OfChtⅢ-△2对乙二醇几丁质的水解效率要远远高于胶体几丁质和a-几丁质。OfChtⅢ-1与OfChtⅢ-△2和OfChtⅢ-2对于三种高聚底物的水解都没有体现出协同作用。(4)OfChtⅢ断裂时期分析及全长蛋白获取。Westernblot证明OfChtⅢ的断裂发生在酵母细胞内。推测可能是由于毕赤酵母的分泌表达途径中的蛋白酶将OfChtⅢ水解。分别通过向培养基中加入蛋白酶抑制剂、酪蛋白水解物改造培养基;将目的基因构建到蛋白酶缺陷型毕赤酵母菌株SMD1168以及将OfChtⅢ的linker部位的Lys和Arg突变成Asn尝试全长蛋白表达,但是这三种方法都没能成功获得全长蛋白。(5)成功构建并表达全长蛋白OfChtⅢ-DGY。将目的基因构建到胞内表达载体pPIC3.5k中,利用金属螯合层析进行分离纯化,纯度较低,利用4MU-β-(GlcNAc)2测定各组分的比活力,发现目的蛋白可能被150mM咪唑洗脱下来。利用凝胶筛分进一步纯化,得到分子量约为92.4kDa的蛋白,并对其进行Westernblot及NativePAGE和底物胶电泳验证,结果证明获得的蛋白是OfChtⅢ-DGY,但是蛋白的表达量很低,表达条件需要进一步摸索及优化。