产几丁质酶菌株的筛选、鉴定及其抑制玉米秸秆霉变研究.doc

产几丁质酶菌株的筛选、鉴定及其抑制玉米秸秆霉变研究我国玉米秸秆在逐步实现机械化打捆收储后,因收获时天气多变,水分含量高,混入泥土等原因,秸秆捆内极易滋生霉菌,造成玉米秸秆资源浪费,且对奶牛等反刍动物健康构成极大威胁。目前常用的丙酸、丙酸盐、氧化钙等化学防霉剂因添加量大、成本高、对工作人员和加工设备具有损伤作用,使其在玉米秸秆这一廉价资源的应用上受到限制。本试验以产几丁质酶枯草芽孢杆菌BS-1、产酸植物乳杆菌LABP以及玉米秸秆中优势霉菌为研究对象,探究BS-1和LABP对玉米秸秆中霉菌的抑制作用,为提高秸秆利用率,提供理论依据。本试验利用胶体几丁质培养基从玉米秸秆中筛选出一株产几丁质酶菌株BS-1,同时将秸秆中的优势霉菌进行分离、纯化;通过对BS-1菌株和优势霉菌形态学观察以及16SrDNA或18SrDNA序列测定进行菌种鉴定;利用3,5-二硝基水杨酸(DNS)比色法测定BS-1菌株发酵24h、48h、72h、96h、120h、144h、168h的几丁质酶活力;利用牛津杯琼脂扩散法检测BS-1菌株发酵液对玉米秸秆中优势霉菌的抑制作用;于玉米秸秆培养基中接种BS-1、LABP及其复合菌剂,验证三组菌株对玉米秸秆的利用情况;采用析因设计,玉米秸秆含水量依次为15%、20%、25%,分别添加BS-1、LABP及其复合菌株处理,以0.5%丙酸为阳性对照,无处理为空白对照,共15个处理组,密闭真空保存30d后开封进行有氧存放,分别于密封前、有氧存放0d、5d、10d、15d取样测定常规养分含量变化、有氧稳定时间、霉菌数量以验证抑菌效果。得到的主要试验结果如下:(1)玉米秸秆中分离出产几丁质酶菌株BS-1经鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis);4株优势霉菌经鉴定分别为卷枝毛霉(Mucorcircinelloides)、尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)、米曲霉(Aspergillusoryzae)、黑曲霉(Aspergillusniger)。(2)BS-1菌株在37℃下培养120h产几丁质酶活力达到最高值3.23U/mL。(3)BS-1菌株发酵液对4株优势霉菌均有明显抑制作用,抑菌圈直径分别为18.13mm、18.48mm、17.55mm、15.68mm。(4)玉米秸秆霉变初期(15d以内)DM、淀粉含量显著下降(P<0.05),而CP、NDF含量呈上升趋势,对ADF则无显著影响(P>0.05),且随着霉变程度加重,各营养指标变化幅度增加,以淀粉相对损失率最高。(5)当玉米秸秆含水量为20%时,BS-1和LABP复合菌剂处理后,秸秆的有氧稳定时间低于丙酸处理,差异不显著(P>0.05),但显著长于空白对照(P<0.05);而当玉米秸秆含水量为25%时,试验组和对照组均发生了严重霉变,产生明显的肉眼可见的霉菌斑点。(6)当玉米秸秆含水量为20%时,BS-1和LABP复合菌剂处理后,霉变最严重时,秸秆中霉菌总数在104cfu/g范围内,而空白对照达到了106cfu/g。而当秸秆含水量为25%时,试验组和对照组霉菌总数均达到了106cfu/g。由上述结果得到如下结论:筛选到的产几丁质酶枯草芽孢杆菌BS-1能够有效抑制造成玉米秸秆霉变的卷枝毛霉、尖孢镰刀菌、米曲霉、黑曲霉等优势霉菌的生长。当玉米秸秆含水量为20%时,添加107cfu/g的BS-1、LABP复合菌液处理能够在一定程度上抑制玉米秸秆中霉菌的生长,增加玉米秸秆的有氧稳定性,降低其常规营养成分损失率,其效果与0.5%丙酸处理相近;而玉米秸秆含水量为25%时,各处理对抑制其霉变均无显著效果。