不结球白菜抗坏血酸合成相关基因的克隆与表达及BcPMI2的功能分析.doc

不结球白菜抗坏血酸合成相关基因的克隆与表达及BcPMI2的功能分析抗坏血酸(AsA),又称维生素C,是动植物体内维持生命所必需的一种物质。植物的AsA含量由AsA合成和消耗的速率共同决定。高等植物中AsA合成的主要途径是L-半乳糖途径,L-半乳糖途径包括8个典型的生理生化反应,也就对应着8个催化这些反应的酶,植物通过调节编码这些酶的基因的表达量改变细胞内这些酶的总活力,从而调节AsA的合成速率和AsA的积累。通过外界或人为地改变一些酶的活力同样可能影响到植物AsA的积累。1.测量经过高pH值处理的植物样品提取液与未经过高pH值处理的提取液在245nm下吸光值的差值,可以计算植物样品提取液中的还原型AsA的浓度。本研究针对该方法比较了不同的方法降解AsA的效果。最后应用该方法测定不结球白菜样品的AsA含量,并与红菲罗啉法测定AsA的结果进行比较,两种方法对于不同样品的AsA含量高低关系基本一致。本方法加标回收率在90%以上,同品种的测定结果的标准偏差在2%-12%之间。2.本研究在贮藏过程中采用二氧化碳气体(CO2)处理采后不结球白菜,减缓了AsA含量的下降。同时发现其他活性物质,包括可溶性蛋白和叶绿素的损失都可被CO2抑制；CO2处理可抑制过氧化氢清除酶系统中的过氧化氢酶(CAT),抗坏血酸过氧化物酶(APX)和过氧化物酶(POD)活力的升高,说明高浓度CO2可以降低植物衰老过程中活性氧胁迫的影响,从而减少AsA等活性物质的消耗。50%和100%的CO2处理都可延缓采后不结球白菜贮藏过程中AsA含量的下降,而前者的处理效果要优于后者。在室温下(25℃)CO2处理对AsA的保持效果较明显,4℃下CO2处理的效果没有明显优于空气处理；在CO2处理的条件下,不同温度处理对AsA的改变也不明显。3.L-半乳糖途径各个基因的表达量对AsA积累有决定性的作用。本研究克隆了7个L-半乳糖途径的相关基因,采用实时定量PCR的手段分析了L-半乳糖途径的各个基因在AsA含量不同的品种中的表达差异。结果表明不结球白菜品种‘乌塌菜’的AsA含量较高并不是因为L-半乳糖途径中某个基因的表达量较高。5mM的茉莉酸甲酯可以短暂地提高AsA含量。L-半乳糖途径中8个基因,除了BcVTC4,其余的基因均明显受到茉莉酸甲酯的诱导上调。BcVTCl,BcGME,BcVTC2和BcGLDH4个基因在茉莉酸甲酯处理后的3h即表现表达量上调,这4个基因可能就是茉莉酸信号诱导AsA积累的几个调控的靶基因。4.PMI是L-半乳糖途径第一步反应的催化酶。本研究用转基因手段将不结球白菜中编码PMI的基因BcPMI2在烟草中过量表达,经过GUS组织化学染色,PCR鉴定得到阳性转基因植株8株；通过RT-PCR检测,选取目的基因正常表达的P1和P2两个转基因植株进行后续研究。结果表明BcPMI2在烟草中的过量表达不仅没有提高烟草叶片的AsA含量,反而使正常生长状态的烟草的叶片AsA含量降低,同时使叶片的可溶性糖含量降低。但BcPMI2在烟草中的过量表达提高了其叶片的过氧化氢耐受能力；转基因烟草的叶盘经过低浓度的过氧化氢处理3d,其AsA的含量高于同样条件处理的野生型烟草叶盘。BcPMI2在烟草中的表达可能提高了L-半乳糖途径合成AsA的潜力,从而在烟草组织遭受氧化胁迫需要大量AsA时,保证L-半乳糖途径高效的运作而不受底物的限制,这可能正是BcPMI2过量表达可以提高烟草叶片过氧化氢耐受能力的原因。