PEG-ceramide纳米胶束诱导N2a细胞自噬降解Tau蛋白的研究.doc

PEG-ceramide纳米胶束诱导N2a细胞自噬降解Tau蛋白的研究阿尔茨海默病(Alzheimer’sdisease,AD)是一种临床常见的神经退行性疾病,以记忆力下降、行为异常、学习功能及社交功能障碍为主要临床表现,占全部老年期痴呆的80%左右。其主要病理机制是淀粉样β蛋白聚集和Tau蛋白的异常磷酸化,许多其他因素以复杂的方式促成AD的病理进展。自噬(Autophagy)是细胞正常的,调节性的回收衰老成分,清除结构或功能异常细胞器或蛋白聚合物的细胞生理过程。在神经系统退行性疾病中,细胞自噬能力下降,导致异常沉积或者错误折叠的蛋白质无法被有效清除,引起相应临床症状。目前有许多研究表明小分子活性物质可以诱导细胞自噬达到清除细胞过表达蛋白的目的,但对于中枢系统,血脑屏障的存在使得绝大部分分子无法顺利入脑,发挥效益,而纳米医学的出现给予了脑靶向治疗策略新可能,部分纳米材料被证实可以诱导细胞自噬的发生。在过去的研究中,我们制备了一种稳定且低毒的纳米药物载体——PEG-ceramide纳米胶束,国内外目前未有相关研究探讨其潜在治疗AD的可能性,基于此,我们假设这种新型纳米材料可能通过诱导细胞自噬而清除过表达的Tau蛋白。在第一部分实验,我们通过薄膜分散法,进一步优化处方,成功制得稳定的空白PEG-ceramide纳米胶束,并测定其粒径及Zeta电位。其次建立了N2a细胞的培养方法,构建体外神经系统模型,并通过CCK8法考察PEG-ceramide纳米胶束的细胞毒性。第二部分实验,我们采用经典的WesternBlot方法检测PEG-ceramide纳米胶束对N2a细胞自噬相关蛋白LC3及自噬底物蛋白p62含量的影响,判断其对细胞自噬水平的影响。结果显示LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比例升高,p62表达水平下降,提示自噬活化。其次我们采用目前主流的细胞自噬流检测方法,使用表达mRFP-GFP-LC3融合蛋白的病毒感染细胞,并标记及追踪LC3,共聚焦显微镜观察细胞荧光表达。结果提示PEG-ceramide纳米胶束处理的N2a细胞自噬小体及自噬溶酶体斑点明显增多,呈现增强的自噬流趋势。第三部分实验,我们通过质粒转染,使N2a细胞表达WT-Tau及P301L-Tau两种人类Tau蛋白,然后采用WesternBlot方法检测PEG-ceramide纳米胶束对细胞内LC3及Tau蛋白水平的影响。结果显示PEG-ceramide纳米胶束可以增加细胞LC3-Ⅱ/Ⅰ的比例,激活自噬,同时下调细胞内WT-Tau及P301L-Tau的含量。综上,我们初步证实PEG-ceramide纳米胶束可以增强细胞的自噬及自噬流,并可能通过调节自噬的途径降解N2a细胞中过表达的的人Tau蛋白含量。随着研究进一步的深入,我们相信这种纳米胶束可在未来用于AD的诊疗策略之中。