TRV载体构建方法.doc

引物设计根据所需要沉默的基因序列设计引物。如需沉默家族基因，设计引物克隆保守片段；如需沉默特异基因，可选择非保守区域或3’非编码区设计克隆片段。插入片段长度在150bp–1000bp均可（在300bp–800bp沉默效果较好，一般为300-800bp,太小则降低沉默效率；太大则不稳定，易造成片段缺失。沉默单个基因选择目的基因3’端的非保守区域能够保证沉默效果和特异性）。根据上图中的TRV质粒图谱，在引物两端加入相应的酶切位点(首先对基因片段自身的酶切位点进行分析，要选择基因片段上没有的酶切位点；质粒上的两个酶切位点最好不要紧接在一起的)。在TRV载体中，正向和反向插入均不影响沉默效果，但一般选用的是正向插入。2、酶切克隆得到的片段（为了保证片段碱基的准确性，一般可以用Pfu+rTaq）,连接T载体,转化大肠杆菌，摇菌PCR检测后送测。检测DNA序列比对无误后，摇菌，提质粒，双酶切（要看Takara含酶这本书，找单酶切或是双酶切的Buffer,尽量在前面的引物设计中考虑加入能双酶切的酶切位点）得到目的基因片段（如果片段较小，酶切的质粒浓度相应提高）。注意：这一步骤可以是连接T载体后，将PCR检测后的阳性克隆选出几个提质粒，同时做几个酶切，将能酶切成功的一个片段回收，并将那个质粒或菌液送测，送测验证序列的正确性。同时，将pTRV2的空载体质粒转化大肠杆菌，PCR检测，再摇菌，提质粒，双酶切，氯仿、乙醇沉淀（先加水放大体系，1：1加氯仿，用无水乙醇和70%乙醇沉淀）后跑胶，胶回收得到酶切后的pTRV2载体片段。连接方法同连接T-EASY载体转化农杆菌将连接产物首先转化大肠杆菌，PCR检测，送测（用pTRV2引物测序）。测序无误后，摇菌，提质粒。将提取的构建好的病毒载体质粒转入农杆菌GV3101（Kan）。同时也将RNA1质粒转入农杆菌GV3101。