微生物的分离纯化.doc

(完整word版)微生物的分离纯化(完整word版)微生物的分离纯化(完整word版)微生物的分离纯化微生物的纯化分离方法自然界中的微生物几乎都是混杂在一起的。分离和纯化的目的是从各种样品来源混杂的微生物群体中获得纯种微生物,即在一定的条件下培养、繁殖得到只有一种微生物的培养物（也称为纯培养物），要找出化妆品生产各环节造成微生物污染的原因，明确污染菌的数量和组成，了解污染菌的生理生化特性，首先必须进行样品中微生物的分离纯化技术.实验目的掌握常用微生物分离纯化方法了解样品的预处理方法实验原理将样品进行一定的稀释，使得每一个细胞尽量能够单独分散存在,通过适当的方法将某个细胞挑选出来，这个细胞就成为纯种。常用菌种分离纯化的方法有稀释混合倒平板法、稀释涂布平板法、平板划线分离法、亨盖特稀释摇管法、液体培养基分离法、单细胞分离法和选择培养分离法等。其中前三种方法最为常用，不需要特殊的仪器设备,分离纯化效果好.实验材料含菌样品培养基：营养琼脂培养基培养皿、接种针、涂布棒、试管、移液管、天平、三角瓶、称量纸实验方法与步骤1.稀释混合倒平板法平板是指经熔化的固体培养基倒入无菌培养皿中，冷却凝固而成的盛有固体培养基的平皿。该法是先将待分离的含菌样品用无菌生理盐水作一系列的稀释(常用10倍稀释法，稀释倍数要适当），然后分别取不同稀释液少许(0。5～1mL）于无菌培养皿中，倾人已熔化并冷却至50℃左右的琼脂培养基，迅速旋摇，充分混匀。待琼脂凝固后，即成为可能含菌的琼脂平板于恒温箱中倒置培养一定时间后，在琼脂平板表面或培养基中即可出现分散的单个菌落。每个菌落可能是由1个细胞繁殖形成的。挑取单个菌落,一般再重复该法1~2次，结合显微镜检测个体形态特征，便可得到真正的纯培养物。若样品稀释时能充分混匀，取样量和稀释倍数准确，则该法还可用于活菌数测定。稀释混合倒平板法有两个缺点，一是会使一些严格好氧菌因被固定在琼脂中间，缺乏溶氧而生长受影响，形成的菌落微小难以挑取，二是在倾入熔化琼脂培养基时,若温度控制过高，易烫死某些热敏感菌，过低则会引起琼脂太快凝固,不能充分混匀.2、稀释涂布平板法稀释涂布平板法是将已熔化并冷却至约50℃（减少冷凝水)的琼脂培养基，先倒入无菌培养血中，制成无菌平板.待充分冷却凝固后，将一定量（约0.1mL或0.2mL)的某一稀释度的样品悬液滴加在平板表面，再用三角形无菌玻璃涂棒涂布，使菌液均匀分散在整个平板表面，倒置温箱培养后挑取单个菌落.玻璃涂棒连续涂布分离法是一种简单快速有效的涂布平板法,可省去含菌样品悬液的稀释，直接吸取经振荡分散的样品悬浮液1滴加人1号琼脂平板上,用一支三角形无菌玻璃涂棒均匀涂布，用此涂棒再连续涂布2号、3号、4号平板(连续涂布起逐渐稀释作用，涂布平板数视样品浓度而定），翻转此涂棒再涂布5号、6号平板,经适温倒置培养后挑取单个菌落。样品稀释混合倒平板法稀释涂布平板法3、平板划线分离法先制无菌琼脂培养基平板，待充分冷却凝崮后，用接种环以无菌蘸取少量待分离的含菌样品，在无菌琼脂平板表面有规则地划线。划线的方式有连续划线、平行划线、扇形划线或其他形式的划线.通过这样在平板上进行划线稀释，微生物细胞数量将随着划线次数的增加而减少,并逐步分散开来。经培养后，可在平板表面形成分散的单个菌落。但单个菌落并不一定是由单个细胞形成的，需再重复划线1~2次，并结合显微镜检测个体形态特征，才可获得真正的纯培养物。菌落形态观察平板分离获得的单菌落可以用肉眼观察,必要时可用放大镜检查。不同的菌落特征不同，描述平板上的菌落可从以下几个方面进行。（1）菌落大小:用格尺测量菌落的直径.大菌落（5mm以上)、中等菌落（3～5mm）、小菌落(1～2mm）、露滴状菌落（1mm以下).（2)表面形状：分光滑、皱褶、颗粒状、龟裂状、同心环状等.（3）凸起情况:分扩展、扁平、低凸起、凸起、高凸起、台状、草帽状、脐状、乳头状等.(4）边缘状况：分整齐、波浪状、裂叶状、齿轮状、锯齿形等。（5）菌落形状：分圆形、放射状、假根状、不规则状等。（6）表面光泽:分闪光、金属光泽、无光泽等.五、实验注意事项1.样品应做好预处理，选择合适的稀释度。2.取样时，每取一个稀释度，无菌吸管应更换一次。划线时应注意勿将培养基划破.六、思考题1.比较划线分离法与涂布稀释分离法的优缺点?2.在平板划线过程中，为什么每划完一个区后要将接种环上的残留菌烧去?3.为何平板培养物采用倒置培养方式？