纤维素酶分离纯化方案.doc

纤维素酶的分离及纯化方案纤维毒酶已广泛应用于食品、医药、饲料和纺织等领域。纤维素酶来源广泛、组分复杂,各组分的分子量和等电点相差很小,分离纯化工作比较困难；而纤维素酶的分纯工作非常重要,只有得到纯酶,才能了解其组成、性质及相互关系,并可根据纤维素酶的不同理化性质纤维材料的作用特点,开展纤维素降解机制的研究,为纤维素酶分子结构研究、酶基因克隆、新酶分子的构建和ＤＮＡ体外定点诱变等提供依据。1材料1.1粗酶液：取菌种发酵液于4℃,8000rpm,离心15分钟,收集上清液即为粗酶液。1.2纤维素酶分离纯化材料与介质透析超滤材料:10,000ＮＭＷＬ透析袋;分离纯化介质:SephadexG-100；SephadexG-75；SephadexG-501.3主要仪器:柱层析系统；ＤＹＹ-2稳压稳流电泳仪；ＤＹＹ-ｍ24Ｄ型电泳槽；层析柱50ｃｍ×2.6cm；紫外检测仪；记录仪;分步收集器;高速冷冻离心机;全温震荡培养箱。2方法2.1纤维素酶活力测定方法:3,5-二硝基水杨酸（DNS）法测定纤维素酶活力纤维素酶水解纤维素产生的纤维二糖、葡萄糖等还原糖能将碱性条件下的3,5-二硝基水杨酸（DNS）还原，生成棕红色的氨基化合物，在540nm波长处有最大光吸收，在一定范围内还原糖的量与反应液的颜色强度呈比例关系，利用比色法测定其还原糖生成的量就可测定纤维素酶的活力。2.2蛋白质含量测定：采用Bradford法测定蛋白质含量,以牛血清白蛋白(ＢＳＡ)做标准曲线。采用考马斯亮蓝G250(Coomassilebrilliantblue，G250，简称CBB—G250)作为染色物质。依其存在形式不同可表现为红色和蓝色，当CBB—G250单独存在时为红色；当其与蛋白质结合后，其颜色变为蓝色。蓝色的深浅与溶液中的蛋白质含量(0～1000μg/mL)成正比，故可用于测定蛋白质含量。2.3纤维素酶的分离纯化方法2.3.1粗酶液的制备:取发酵液于4℃,8000rpm,离心15分钟,收集上清夜即为粗酶液。测定粗酶液中纤维素酶活,蛋白质含量。2.3.2硫酸铵沉淀和透析:取粗酶液,加入硫酸铵至25%饱和度,4℃,10000rpm,离心10分钟,分别测沉淀物和上清液中的酶活,酶活集中于沉淀物中,收集沉淀物溶于少量0.05ｍｏｌ/ＬＰｈ6.0磷酸缓冲液中,透析除盐,得到经硫酸铵沉淀的纯化酶液,此为分子筛柱层析上样样品。2.3纤维素酶的分离纯化方法2.3.3葡聚糖凝胶层析葡聚糖凝胶SephadexG-100；SephadexG-75；SephadexG-50,充分溶胀,抽气,分别装柱(50cm×2.6cm),用0.05ｍｏｌ/ＬｐＨ6.0磷酸缓冲液充分平衡后上样,选择合适的流速、检验器灵敏度，测定出现吸收峰各管的纤维素酶活及蛋白含量。根据不同凝胶的层析图谱判定最适的一种。2.3.4SDS-SPGE采用垂直板式不连续系统电泳,分离胶浓度12%,浓缩胶浓度4%,用0.25%(Ｗ/Ｖ)考马斯亮蓝Ｒ-250酸性乙醇水染色。说明：凝胶过滤层析条件温和、简便、分离范围广、回收率高,对生化物质的分离十分适宜。由于酶易失活，故分离纯化工作于4℃下进行，实验中用到的各溶液、器皿均应先预冷。加硫酸铵时要慢，同时搅拌，防止局部盐浓度过高。搅拌速度也不要太快，防止蛋白质表面变性。装柱时，胶悬桨不要太稀也不要太稠，太稠易带入气泡，太稀则需分次才能装完。上样和换层析液时，要保持床面平整，同时床面不能流干。