关于重组人血白蛋白的系统性表述.doc

../NUMPAGES11.关于重组人血白蛋白的系统性表述人血白蛋白（HSA）作为一种重要的临床急救药物及重要的药物辅料，在医药，科研及化妆品生产等领域应用广泛。随着国内医疗水平及居民收入水平的提升和对血液制品认知度的提高，血液制品的临床使用量不断增加，市场容量不断增长，行业快速发展。根据国家医药管理局的报告，2010年全国16城市医院血液系统用药金额约62亿元，其中白蛋白类药物占据了血液制品的主要份额（大于50%）。但作为一种血液制品，HSA同时也面临原料短缺及病毒污染等缺陷的影响。用基因工程重组人血清白蛋白（rHSA）替代HSA是国际上公认的最有前途的高新技术途径。什么是重组人血白蛋白1.定义通过基因重组的技术将目的蛋白的基因克隆后，将该基因插入到某种生物（如细菌、酵母、植物，哺乳动物细胞等）中进行复制，然后收集的白蛋白称为重组人血白蛋白。rHSA的等级分类按不同的质量标准分为了培养基级、药用辅料级和药用注射级（药用级）三类，三类级别的重组人血白蛋白生产工艺相同，但最终控制参数不同，药用级白蛋白质量标准最高。3.rHSA的表达系统分类白蛋白(HumanSerumAlbumin,HSA)是一组复杂的大分子蛋白质，必须经过正确的折叠、组装和翻译后修饰，才能赋予其特定的结构和功能，表达系统是重组人血白蛋白生产过程中极其重要的环节。原核表达系统HSA基因最早就是在原核生物大肠杆菌(E.coli)中表达成功的，Lawn等于1981年首次报道了rHSA的cDNA序列并首次构建了第一个表达rHSA的表达载体pHSA，然后在E.coli中表达成功，表达量为细胞总蛋白的7%，但E.coli表达系统体外很难正确折叠和组装结构复杂的HAS，缺乏翻译后的修饰和加工，表达的蛋白多形成包涵体，且纯化较难，所以未能得到有生物功能的蛋白，细菌细胞壁脂多糖还会造成热反应。因为HSA在原核生物中表达量不高且分泌效果不够理想，所以研究的重点转向其在真核生物细胞中的表达。酵母表达系统酵母作为单细胞真核生物，既具有原核生物的容易培养、生长繁殖快、相对易于进行基因工程操作等优点，还具有原核生物缺少的其他优点，如蛋白质翻译后修饰和加工以获得有生物活性的重组蛋白，表达量和分泌量较大，易于产业化培养，非常适合白蛋白及其他非糖基化血浆蛋白的大规模制备。研究者们用到的酵母表达系统有毕赤酵母(Pichiapastoris)、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、汉逊酵母(Hansenulapolymorpha)、克鲁维氏酵母(Kluyveromyceslactis)等。在酿酒酵母中，Okabayashi等通过构建在染色体LEU2和HIS4位点上整合的质粒获得能连续分泌rHSA的稳定转化株，每升培养基达到85mgrHSA。毕赤酵母表达量和分泌量高且稳定，自身分泌蛋白量小，作为基因表达系统研究和使用的最多，已基本掌握其生长规律及大规模高密度发酵技术，被认为是最有发展前景的蛋白质生产工具之一。毕赤酵母非常适合人血白蛋白等非糖基化血浆蛋白的大规模制备，成为目前rHSA的主要表达系统。其他表达系统作为“生物反应器”的转基因动物自1987年以来就引起学者们广泛的关注。就生产rHSA来说，最理想的表达场所是乳腺，因为乳腺是外分泌器官从而不会影响转基因动物本身的生理，表达的蛋白能经过充分的翻译后修饰加工，组织细胞密度高从而分泌水平高，目标蛋白纯化相对容易。2000年黄淑帧等通过乳腺表达载体构建、显微注射、卵母细胞体外成熟和受精以及整合胚移植等技术成功将HSA基因整合入牛体内，转基因牛研制的总有效率为12.5%。rHSA在老鼠的乳腺中也得到了成功表达且分泌量较高，达到11.9g/L。但该表达系统存在病毒及朊病毒污染的风险，在产业化之前还有很多困难需要克服。国内外也有转基因植物生产rHSA，但是该系统要实现产业化，需要克服植物合成的非人类糖可能导致免疫原性、田野或温室等标准操作规范等问题。各种系统表达重组人血白蛋白的比较表达系统总成本产品周期规模化生产的能力产品性能污染风险存储成本细菌低短高低内毒素中酵母中中高极高低低转基因动物高极长低极高朊病毒和致癌病毒高转基因植物中长高高低低4.与HSA相比的相对优势目前该技术主要以酵母做为蛋白表达式生产，具有以下显著特征：一是，rHSA与HSA的结构一致，临床疗效也相同。二是，rHSA是利用现代生物发酵技术生产的白蛋白产品，不仅可提高产品的纯度，而且其质量明显优于血源提取物。三是，采用基因重组方法生产白蛋白可实现大规模工业化生产，产量不受资源限制，从而降低白蛋白的生产成本。四是，无动物源，可以有效避免人血白蛋白携带病毒等风险。rHSA的技术难点rHSA的纯化不同于pHSA等血浆蛋白及其它的重组蛋白，主要在于：1）