植物组织培养中的-褐化现象-和解决途径.ppt

植物组织培养中的褐化现象和解决途径1.褐化：植物组织培养中所说的褐化(browing)是指在外植体诱导初分化或再分化过程中，自身组织从表面向培养基释放褐色物质以至培养基逐渐变成褐色，外植体也随之进一步变褐而死亡的现象。2.褐化、污染和玻璃化并称为植物组织培养的三大难题，且控制褐化比控制污染和玻璃化更加困难褐化发生的形式及褐化发生机理影响褐化的因素防止褐化的途径展望褐化发生的形式及褐化发生机理酶促褐化必须具备酶、底物和氧三个条件。1.酶：多酚氧化酶（PPO）、过氧化物酶（POD）、苯丙氨酸解氨酶（PLA）等。2.底物：酚类化合物3.氧气酚类物质的共同结构特点是都含有带羟基的苯环结构.按其组成结构可分为:1.苯基羧酸类（包括邻羟基苯酚、儿茶酚、没食子酸、莽草酸等）、2.苯丙烷衍生物（包括绿原酸、肉桂酸、香豆酸、咖啡酸、单宁、木质素等）、3.黄烷衍生物（包括花青素、黄酮、芸香苷等）三大类。酶和底物的深入研究已经为酶促反应体系理论的研究奠定了基础。1.Mayer(1979)发现酚类物质的含量与其褐变率成正相关，提出了果实组织细胞中酚类物质和PPO的区域化分布假说。2.鞠志国(1988)证实：莱阳梨细胞中的酚类物质集中于液泡，而PPO则主要分布于细胞质中，并且果实内总酚含量与其褐变密切相关。3.罗晓芳等(1999)的研究表明，酚类物质的总含量与褐变有一定的关系，同时易被褐变的材料的褐变程度随培养时间的延长不断增加。影响褐化的因素一.植物种类及基因型1.不同物种之间褐化程度差异很大2.同种植物的不同品种间也存在一定差异橡胶树的花药培养中，发现海垦2号花药的褐变较少，因而愈伤组织化容易，而有些品系花药容易褐化，诱导困难；银杏的众多品系中佛手品系比梅核品系诱导愈伤织困难。这些可能是由于外植体的基因型差异引起的。二.外植体部位、生理状态、取材时期、外植体的大小及受伤程度邱璐等(2000)用桑树基部发出的幼芽作外植体比用上部高大枝条的壮枝上的壮芽作外植体褐化轻、褐化率低，幼龄树比老龄树褐化轻、褐化率低。Gannoun等(1995)报道，阿月浑子2年和4年生材料的组织培养获得成功，但8年和26年生材料则出现褐化现象。Wang等(1987)报道“富士”苹果和“金华”桃在9月到2月取材褐变轻，5月到8月取材褐变重。可见，外植体的选择对对组织培养的成败至关重要。三.培养基成分、培养条件及培养方式1.无机盐浓度过高的无机盐浓度会引起植物外植体的褐化，这在油棕和云桑的组织培养中得到体现。2.光照甘蔗胚性细胞在过强的光照（2500Lx以上）下，细胞团表面容易褐变，弱光下则会出现绿色芽点。3.温度高温能促进酚类氧化,而低温可以抑制酚类化合物的合成,可以降低多酚氧化酶的活性,减少酚类氧化,从而减轻褐变。4.抗氧化剂抗氧化剂对核桃、桑树和荔枝的组织培养中外植体的褐化程度影响很大。防止褐化的途径二.对外植体进行预处理预处理包括：流水冲洗、低温消毒、接种前用无菌水冲洗等。对易褐变的材料经流水冲洗后放在2-50C的低温下处理12-24h，经消毒处理后接种到只含有蔗糖和琼脂的培养基上培养5-7d，一方面使外植体中的酚类物质部分渗入培养基，另一方面使外植体伤口愈合，这样可使外植体褐化程度减轻。三.选择适宜的培养基和培养条件组培中外植体的褐化是植物在一种逆境下的适应性反应，因此,在最适宜的培养条件下,外植体处于旺盛的生长状态,有较强的分生能力,便可大大减轻褐化。卡德兰开始培养时，温度保持在15-200C，培养基PH调节至5.5有助于减轻褐化的程度。四.添加褐变抑制剂和吸附剂1.褐变抑制剂：包括抗氧化剂和PPO的抑制剂。水解乳蛋白，硫脲、二氨基二硫代甲酸钠、氯化钠是PPO的抑制剂。2.吸附剂：a.可溶性聚乙烯吡咯烷酮(PVP)是酚类物质的专一性吸附剂b.活性炭是一种吸附性较强的无机吸附剂何琼英等(1998)在苦丁茶体细胞组织培养前，将苦丁茶茎段经常规消毒后用可溶性聚乙烯吡咯烷酮（PVP，2g/L）浸泡10-15min，并在培养基中加入活性炭（AC，1g/L），获得较好的防褐效果。黄浩(1999)认为水解乳蛋白的抗褐变原因一方面是弱酸性物质与酚类的羟基作用形成酯类，减少PPO作用底物的浓度；一方面是水解乳蛋白竞争性地与底物结合的结果。亚硫酸盐可直接抑制酶，它与反应的中间体相互作用阻止中间体参与反应形成褐色色素，或作为还原剂促进醌向酚的转变。五.多次转移将外植体很快转移到新鲜培养基上2-3次，在某些情况下可以缓解褐化，可能是在这段时间内外植体的切口逐渐愈合，外渗停止的原因。在兰花、无花果、核桃的组培中使用了这个方法，收到了良好效果。在外植体接种后的1-2天立即转移到新鲜培养基中或同一瓶培养基的不同部位，这样能减轻醌类物质对培养物的毒害作用，连续转移5-6次可基本解决外植体的褐变问题。