筛选标记和目的基因.ppt

筛选标记与目的基因筛选标记基因是一种已知功能或已知序列的基因，能够起着特异性标记的作用。在基因工程意义上来说，它是重组DNA载体的重要标记，通常用来检验转化成功与否筛选标记基因在遗传转化中担负着区分转化体和非转化体的重要作用。合适的筛选标记基因及其相应的筛选剂是转基因成功的关键。1.新霉素磷酸转移酶II(NPTII)(nptII)nptⅡ基因最初是从大肠杆菌转座子Tn5中分离得到的，即氨基糖苷磷酸转移酶Ⅱ基因，它编码的氨基糖苷磷酸转移酶使抗生素被磷酸化而失活。因此nptⅡ基因作为筛选标记基因可以使转化细胞对抗生素如卡那霉素、G418、巴龙霉素、新霉素等产生抗性，进而达到筛选的效果。目前，该基因仍是植物基因工程中运用很广泛的选择标记基因。2.潮霉素磷酸转移酶(HPT)(hpt)从大肠杆菌中分离出来的hpt基因可以编码HPT，使其具有潮霉素B的抗性。hpt基因被证明是单子叶植物较为理想的筛选基因，因其选择效率高、基因型差异小、对转化细胞不产生或很少产生毒害作用、再生的转基因植株育性较好等优点在水稻、玉米和小麦等作物上得到了广泛应用。目前，大多数转基因水稻的有关研究中，均以HPT作为抗性选择标记。3.草丁膦N－乙酰转移酶(PAT)(bar)编码PAT的bar基因最初是从吸水链霉菌中分离出来的。PAT能使草丁膦的自由氨基乙酰化，从而使草丁膦对植物无毒害作用。这种筛选体系具有快速简便、高效，细胞产生的假转化体少，并且使植物获得优良的抗除草剂农艺性状的优点。它是目前用得最多的选择标记基因之一。4.α-微管蛋白基因从牛筋草中分离得到的α－微管蛋白基因突变体对二硝基苯胺类除草剂(TFL)具有抗性。目前，已经作为筛选标记基因应用于单子叶植物和双子叶植物遗传转化研究工作中。5.磷酸甘露糖异构酶(PMI)(manA)编码PMI的manA基因最初是从大肠杆菌中分离提取出来的，目前在酵母、动物及人体中都已分离得到编码该蛋白的基因。然而，除肉桂和一些豆类外，自然界的植物中大都没有编码PMI的基因，因此以甘露糖为筛选剂的筛选体系在绝大多数植物的遗传转化中都可以应用。并且被证明对环境和人体健康都十分安全。但是容易受到培养基或外植体内其他糖类水平等生理因素的干扰，因此该筛选体系的完善还有待进一步的研究。6.木糖异构酶(xylA)xylA基因是由赤褐色链球菌和嗜热厌氧杆菌中分离出来的。木糖是半纤维素的主要组成部分，是生物体内含量仅次于葡萄糖的糖类。同甘露糖一样，木糖也是许多植物细胞不能代谢利用的糖类，例如烟草、马铃薯和番茄不能用D-木糖作为唯一碳源。然而木糖异构酶(D-syloseketol-isomerse)可以催化木糖成为D-木酮糖，D-木酮糖可作为碳源。这种筛选方法比nptII基因的筛选效率高10倍左右，并且发芽更快。研究证明这种酶是生物安全的并且在食品工业中得到普遍应用。7.拟南芥ATP结合域(ABC)转运蛋白ABC蛋白是植物中普遍存在的蛋白质。在ABC蛋白质家族中它们有30%～40%的结构是相似的。拟南芥ABC转运蛋白是依据它们结构域的同源性来分类的，但是它们的功能还不是很清楚。植物基因Atwbc19(2178bp)编码一种特殊的拟南芥ABC转运蛋白，这种蛋白可使转基因植株具有卡那霉素的抗性。但是这种抗性机制与转基因烟草用的CaMV35S启动子启动细菌抗药基因的表达机制是不同的。由于ABC转运蛋白是植物内源蛋白，所以在同样的抗性基因遗传转化工作中Atwbc19作为筛选标记可以替代现在应用广泛的细菌标记基因。因此这种标记基因可能对于农业转基因研究来说是具有应用价值的。8.色氨酸合酶beta1(TSB1)色氨酸(Trp)是一种存在于植物中的必需氨基酸，它不能在动物中合成。通常状态下植物并不合成Trp，只有处于伤害环境等胁迫条件下才诱导合成Trp。在植物中，AtTSB1基因的主要作用是将吲哚和丝氨酸转变成为Trp。目前，Hsiao等研究发现AtTSB1基因在植物转基因中可以作为一种新颖的非抗生素筛选标记，对5-甲基色氨酸(5MT)或重金属的选择既简便又快捷。在含有75μM5MT或者300μMCdCl2的MS培养基上筛选转化植株效果很明显。通过以上研究结果得出结论，AtTSB1转基因植物中积累Trp可以限制Cd2+和其他重金属的增加，或者抑制金属转运物的活动。因此，重要的禾本科作物应用AtTSB1基因作为筛选标记基因遗传转化得到的转基因植株能够种植在重金属污染的土壤中。9.氨基糖苷腺苷酰转移酶基因(aadA)双子叶植物叶绿体转化多采用aadA基因，用壮观霉素(spectinomycin)进行筛选，获得同质叶绿体转化细胞的筛选周期不同受体材料差异很大，分化植株的前期筛选一般2～8个月，甜菜叶绿体转化筛选8个月后才分化植株。棉花叶绿体转基因从枪击受体胚性愈伤到获得