淀粉酶菌株的选育发酵工艺的研究和酶的纯化模板.doc

淀粉酶菌株选育、发酵工艺研究和酶纯化摘要：淀粉酶是最早用于工业生产而且迄今仍是用途最广、产量最大酶制剂产品之一，为了提升淀粉酶生产水平，首先经过淀粉培养基从土壤中筛选出产淀粉酶活性菌株，对菌株初步判定后进行紫外线诱变，筛选出产量高、性状优良突变菌株，再用正交试验方法对其发酵条件进行优化，试验最终采取硫酸铵沉淀法初步纯化发酵得到淀粉酶并对酶活性进行了测定。关键词：淀粉酶；分离筛选；紫外线诱变；优化；提纯引言淀粉酶是能够分解淀粉糖苷键一类酶总称，包含α-淀粉酶、β-淀粉酶、糖化酶和异淀粉酶，是最早用于工业生产而且迄今仍是用途最广、产量最大酶制剂产品之一。淀粉酶种类繁多，特点各异，在造纸、印染、酿造、果汁和食品加工、医药、洗涤剂、工业副产品及废料处理、青贮饲料及微生态制剂等多个领域含有宽广用途。中国是传统农业大国，发展淀粉深加工工业是处理目前淀粉生产积压好出路，而几乎全部淀粉深加工工业基础全部是以淀粉质原料水解作为第一步，所以淀粉质原料液化情况直接关系到产品后期加工工艺和产品质量。所以，改善淀粉液化工艺也是降低生产成本，提升产品市场竞争能力一个关键手段。显然，改善淀粉液化工艺首要任务就是提升淀粉酶生产水平。那怎样提升淀粉酶生产水平呢？我们知道，现在淀粉酶关键起源于植物和微生物，并经过发酵完成生产，所以筛选出高产、稳定淀粉酶产生菌是淀粉酶生产头等大事。本文试图从土壤中分离出产淀粉酶枯草杆菌，经过紫外线诱变育种及发酵条件优化来得到高产、稳定淀粉酶产生菌株，并对发酵得到淀粉酶进行初步提纯，以达成加深对发酵工程上游技术中菌种选育认识、掌握紫外线诱变育种原理和方法、了解发酵条件对产物形成影响、熟悉发酵条件优化方法、掌握分光光度法测液化型淀粉酶活力基础原理和方法、掌握初步纯化淀粉酶方法试验目标。2、材料和方法2.1试验材料2．1．1样品：贵师大综合楼周围土壤2．1．2培养基和试剂：淀粉培养基、牛肉膏蛋白胨（斜面）、牛肉膏蛋白胨（液体）种子培养基、淀粉酶发酵培养基、生理盐水、碘液、2％可溶性淀粉、硫酸铵、乙酸溶液、磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、标准糊精溶液2．1．3仪器设备：全自动高压灭菌锅、培养皿、恒温培养箱、超净工作台、恒温摇床、离心机、分光光度计、恒温水浴锅、移液管、PH试纸、吸耳球、玻璃棒、量筒、试管、试管架、酒精灯、电子天平、三角烧瓶、洗瓶、接种针、接种环、直尺、记号笔等。2.2试验方法2．2．1细菌分离和初步判定：将土壤系列稀释，把10-3、10-4、10-5分别涂布到淀粉培养基上，27℃倒置培养2天，将长出菌落接入斜面。将细菌从斜面接种到淀粉培养基培养2天，用碘液染色，统计透明圈大小和菌落直径，计算D/d值。保菌供下次试验用。2．2．2紫外线诱变育种：取活化后菌种配成菌悬液、稀释；倒淀粉培养基平板，将菌悬液涂布其表面；用紫外线处理平板0、2min、4min、6min、8min、10min，每个处理2次反复；放到黑暗中倒置培养，37℃培养48h，分别计数诱变组和对照组平板上菌落数，并计算致死率；加入碘液，分别测量诱变组和对照组菌落透明圈直径和菌落直径，计算D/d值；将D/d值最大菌种保留到斜面培养基上。2．2．3生产菌株摇瓶发酵条件优化2．2．3．1培养基初始pH值和装液量对产酶影响：用1mol/L盐酸或1mol/L氢氧化钠调整培养基pH值，使培养基pH值为5.0、7.0、9.0，分装至250mL三角瓶中，每瓶25mL，灭菌，冷却后编号1、2、3，再接种，37℃下恒温摇床培养48h（摇瓶装液量分别30％、40％、50％），最终测定发酵液酶活。编号处理项1号2号3号PH579装液量30％40％50％A66010-110-22.2.3.2培养基碳源对产酶影响：在不含可溶性淀粉培养基中，分别加入0.5％多种碳源（可溶性淀粉、葡萄糖、蔗糖），以硝酸铵作为唯一氮源，进行碳源对产酶影响发酵试验。处理结果可溶性淀粉葡萄糖蔗糖A66010-110-22.2.3.3正交试验设计：经过三原因两水平正交试验对高产菌发酵条件进行优化，建立高产菌株最好摇瓶发酵条件。因素处理接种量淀粉含量蛋白胨含量处理一3％5g/L5g/L处理二3％10g/L10g/L处理三5％5g/L10g/L处理四5％10g/L5g/L2．2．4淀粉酶初步提纯及酶活性测定2.2.4.1淀粉酶初步提纯：搜集发酵液，3000r/min离心10min，去除菌体，在上清液中加入65％饱和度硫酸铵，待硫酸铵充足溶解后于4℃盐析2h，然后5000r/min离心20min，得到初步纯化淀粉酶。2.2.4.2标准曲线制作和酶活性测定：将可溶性淀粉稀释成0.2％、0.5％、1％、1.5％和2％稀释液，按下表进行标准曲线制作和酶活性测定。管号1234567．17．27．37．4淀粉稀释液/mL2（0％）2（0.2