中草药多糖的分离提取和理化性质研究.doc

东北师范大学生命科学学院题目：中草药多糖的分离提取和理化性质研究姓名：***学院：生命科学学院学号：20110*****年级：2011级2中草药的分离提取和理化性质研究生命科学学院2011级***201101****摘要：本实验采用热水浸提和乙醇醇沉的方法提取刺五加多糖，得到的粗多糖回收率为1.21﹪，再对得到的粗多糖进行定性、定量分析。用苯酚—硫酸法测定已提取出的粗多糖中单寡糖与多糖的含量为14.7%；经过薄层层析分析单糖的组成，其中组成多糖的单糖多属于葡萄糖、阿拉伯糖和甘露糖；用SepharsoseCL—6B柱层析法测定多糖的相对分子量约为3.47万道尔顿。高效液相色谱分析单糖含的结果是刺五加多糖中的单糖种类有半乳糖、葡萄糖、阿拉伯糖、甘露糖等，其中含量较多的葡萄糖和甘露糖。关键词：刺五加多糖分离提取理化性质多糖是由单糖连接而成的多聚物，人们对多糖的研究已经有很长时间的历史，对多糖的初始研究可追溯到1936年Shear对多糖抗肿瘤活性的发现，至20世纪50年代，陆续发现一些真菌多糖和高等植物多糖具有明显的抑瘤活性。最近又发现许多中药多糖还具有降血糖作用。70年代以来，科学家们发现多糖及糖复合物在生物体内不仅是作为能量资源和构成材料，重要的是它存在于一切细胞膜结构中，参与生命现象中细胞的各种活动。多糖类物质是所有生命有机体的重要组成部分，广泛存在于动物、植物和微生物细胞壁中，是生物体内除核酸和蛋白质以外的又一类重要的生物分子。科学研究已经确认糖类物质具有许多生物活性，包括抗肿瘤、免疫、降血糖和抗病毒等，而且对机体几乎无毒副作用。中药多糖因具有增强机体免疫功能及抗肿瘤降血糖等药理作用，而且几乎没有毒性与副作用，因此引起国内外药理学家、生物学家和化学家们的关注。多糖的提取应根据多糖的来源和提取部位的不同确定所用提取方法。多糖的提取方法主要有水提法、酸提法、碱提法、超声提取法和微波提取法等。本次试验的材料为刺五加，采用水提法提取刺五加多糖，利用苯酚一硫酸比色法间对多糖含量进行测定，并依次利用薄层层析法、高效液相色谱法以及分子筛层析对刺五加多糖的理化性质进行分析。1材料与方法1.1实验材料刺五加1.2实验试剂浓硫酸、葡萄糖、6%苯酚、标准样（木糖、半乳糖醛酸、甘露糖、半乳糖、葡萄糖、鼠李糖和阿拉伯糖）、三氟乙酸（TFA）、展开剂（正丁醇：乙酸：水=4：1：5）、显色剂（苯胺—邻苯二甲酸正丁醇饱和水溶液）、1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）、氢氧化钠（NaOH）、浓盐酸（HCl）、磷酸二氢钠（NaH2PO4·2H2O）、磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）、无水乙醇（CH3CH2OH）、无水甲醇（CH3OH）、氯仿（CH3Cl）、超纯水、蓝色葡聚糖，重铬酸钾及相对分子量为15.3万，46.1万的葡聚糖标准品、生理盐水等。1.3实验仪器可见分光光度计、分析天平、离心机、SHIMADZULC-10AT（岛津）液相色谱仪、SHIMADZULC（岛津）色谱柱、层析缸、硅胶板（10×10cm）、毛细管、喷雾器、烘箱、水解小瓶、蒸发皿、吹风机、层析柱1.5cm×100cm、恒流泵、自动部分收集器、紫外检测仪、记录仪、可见光分光光度计、容量瓶、移液枪、试管等。1.4实验方法1.4.1多糖的分离、提取与纯化称取晒干的刺五加约30g，用蒸馏水浸泡约24h后，在80℃下煮提1.5h，用纱布过滤取滤液至铁钢中，再加入少量水按以上方法分别煮提1h、0.5h，将3次得到的滤液在120℃下浓缩至50ml以下，转移至两成为250ml烧杯中，加入3倍体积95%乙醇中，封上封口膜保存。醇沉后倒出上清，将沉淀3000r/min离心15min，取出沉淀，沉淀依次用无水乙醇、乙醚脱水，P2O5真空干燥过夜，即得粗多糖。1.4.2多糖含量测定准确称取无水葡萄糖10mg，加少量蒸馏水溶解，后定容至于100mL，得葡萄糖标准液。分别准确量取标准液0（0号管）、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0mL于大试管中，补加蒸馏水至1.0mL。向每只试管中加入6%苯酚0.5mL，混匀，再加入浓硫酸2.5mL，立即振荡，室温放置10min，以0号管为参比，于490nm测定光吸收值。以葡萄糖的微克数为横坐标，光吸收值为纵坐标，绘制标准曲线。准确称取多糖样品10mg，先用少量蒸馏水溶解，然后定容至100mL，得到多糖溶液。1号管中加入1.0mL蒸馏水，2、3、4号管中加入1.0mL多糖溶液。分别向每个试管中加入6%苯酚溶液0.5mL，振荡混匀，浓硫酸2.5mL，立即振荡。冷却10min后，以1号管作为参比，于490nm测定2-4号管的光吸收值。所得三个数值取平均值，根据标准曲线计算样品中的多糖含量。1.4.3糖组成分析准确称取干燥的糖样5.0mg，加入1.0mL蒸馏水，充分溶解后转