常用菌种分离选育和保藏.ppt

常用菌种的分离、选育和保藏第一节菌种的分离简介二、分离思路定方案：首先要查阅资料，了解所需菌种的生长培养特性。采样：有针对性地采集样品。增殖：人为地通过控制养分或培条件，使所需菌种增殖培养后，在数量上占优势。分离：利用分离技术得到纯种。发酵性能测定：进行生产性能测定。这些特性包括形态、培养特征、营养要求、生理生化特性、发酵周期、产品品种和产量、耐受最高温度、生长和发酵最适温度、最适pH值、提取工艺等。（一）采样2、采样季节：以温度适中，雨量不多的秋初为好。3、采土方式：在选好适当地点后，用小萨子除去表土，取离地面5-15cm处的土约10g，盛入清洁的牛皮纸袋或塑料袋中，扎好，标记，记录采样时间、地点、环境条件等，以备查考。为了使土样中微生物的数量和类型尽少变化，宜将样品逐步分批寄回，以便及时分离。（二）增殖培养（三）培养分离（四）筛选（五）毒性试验第二节培养分离一、成功的分离培养方法二、培养分离中要解决的问题四、自然界中细菌的分离(一)采样和采集方法采样的注意事项5、采好的样应及时处理，暂不能处理的也应贮存于4℃下，但贮存时间不宜过长。这是因为一旦采样结束，试样中的微生物群体就脱离了原来的生态环境，其内部生态环境就会发生变化，微生物群体之间就会出现消长1．土样采集方法2．植物体采集方法3．水样采集方法(二)培养基的组成原则2、所有分离培养基中都应含有抗真菌剂(如放线菌酮和制霉素)，掺加浓度一般为50μg／m1，以抑制真菌的生长。3、琼脂平板在使用前应置于37℃培养箱中孵育l、2天。4、培养基的生物物理学参数，如pH及盐分也应调节到与试样的生态系统参数值相近。富集方法土样中细菌的富集：适度稀释后，取涂布已添加及未添加富集底物(如几丁质、纤维素等)的土浸出汁平板。植物体上细菌的分离：无菌富集，加植物浸出液适度培养取样，洗涤，取1ml经适度稀释后涂布平板。水中细菌的分离：水样通过无菌滤膜，取出滤膜用1ml无菌稀释液将滤膜上的沉积洗下。用样本稀释液适度稀释,涂布平板倒置培养或滤纸压印分离法。水中细菌分离的简易富集技术次代培养及纯化步骤五、放线菌的分离（三）培养基的组成原则放线菌的分离次代培养及纯化六、真菌分离4、选择性富集：是通过一定的方式使样本中一种或一群微生物数量上的增加而利于分离的一种技术。富集可以是种水平的，如通过营养要求的改变来富集分离镰刀菌；也可以是组成群水平的，如以纤维素为唯一碳源的选择性培养基可选择性富集所有能降解纤维素的纤维素裂解微生物。5、选择性抑制培养基可使非目标微生物消除或减少到一定程度。在分离培养基中加入一定的抗生素即可有效地抑制细菌生长及菌落形成。真菌的分离方法第三节工业菌种的育种方针工业菌种育种的方法育种过程选择育种方法时综合考虑的因素工业菌种改良方法(4)抑制或消除产品分解酶。(5)改进菌种外泌产品的能力。(6)消除代谢产品的反馈抑制。如诱导代谢产品的结构类似物抗性。第四节诱变育种诱变化学诱变剂：化学因子如碱基类似物、5—氟尿嘧啶、烷化剂等。化学诱变剂中使用最多、最有效的是烷化剂。使用化学诱变剂的优缺点：1、大多数情况下，就突变数量而言，要比电离辐射更有效。2、化学诱变剂是很经济的，因为只需要少量的合适的诱变剂，设备是实验室的一般玻璃器皿，一个蒸气罩。而用电离辐射±行工作时，设备费用大，并要注意安全性。3、大部分诱变剂是致癌剂，所以在使用中必须非常谨慎，要避免化学诱变剂与皮肤接触，，且切勿吸入其蒸气，有人对某些诱变剂极其敏感，甚至未直接接触就会过敏，这就更要当心。诱变剂的选择3．吖啶类诱变剂可以造成生化代谢途径的完全中断。4．紫外线仍十分有效。电离辐射是造成染色体巨大损伤的最好诱变剂，它能造成不可回复的缺突变。但它可能影响邻近基因的性能。二、诱变育种步骤(一)出发菌株的选择5．要尽量选择单倍体细胞、单核或核少的多细胞体来作出发诱变细胞，这是由于变异性状大部分是隐性的，特别是高产基因。6．根据采用的诱变剂或根据细胞生理状态或诱变谱选择诱变剂，因为同一诱变剂的重复处理会使细胞产生抗性，使诱变效果下降。有的诱变剂是作用于营养细胞，就要选对数期的细胞：有的作用于休止期，就可选用孢子。(二)处理菌悬液的制备(三)诱变处理(四)中间培养方法：让变异处理后细胞在液体培养基中培养几小时，以让细胞的遗传物质复制，让细胞繁殖几代，以得到纯的变异细胞。这样，隐性的变异就会显现出来，若不经液体培养基的中间培养，直接在平皿上分离就会出现变异和不变异细胞同时存在于一个菌落内的可能，形成混杂菌落，以致造成筛选结果的不稳定和将来的菌株退化。(五)分离和筛选紫外线的诱变育种被照射的菌悬液细胞数，细菌为106个／ml左右，霉菌孢子和酵母细胞为106～107个／ml。由于紫外线穿透力不强，要求照射液不要太深，约～厚，同时要用电磁搅拌器或手工