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土壤中反硝化菌的分离与其反硝化能力的分析研究————————————————————————————————作者：————————————————————————————————日期：个人收集整理勿做商业用途个人收集整理勿做商业用途PAGE-20-个人收集整理勿做商业用途土壤中反硝化菌的分离与其反硝化能力的分析研究上海交通大学附属中学高二（9）班姜北辰201209232011—2目录绪论实验材料及方法结果与数据分析分析总结与讨论参考文献摘要：通过对土壤样本进行初筛和复筛，以限制氮源的方法分离出8株具有反硝化能力的微生物，对5株微生物的反硝化能力进行测定，其二周时间硝酸盐降解率最高为100%，最低为66.76％。对此8株菌株的DNA进行PCR扩增,引物为已知的nirS和nosZ反硝化基因的相应引物，发现有三株菌株含有nosZ基因。再对此8株菌株中的7株的16SrDNA进行PCR扩增,鉴定菌种。关键词：反硝化微生物，菌种鉴定,反硝化菌筛选绪论:反硝化作用（denitrification）也称脱氮作用。反硝化细菌在缺氧条件下，还原硝酸盐,释放出分子态氮（N2)或一氧化二氮（N2O）的过程。大部分反硝化细菌是异养菌,例如脱氮小球菌、反硝化假单胞菌等，它们以有机物为氮源和能源，进行无氧呼吸，其生化过程可用下式表示:C6H12O6+12NO3-→6H2O+6CO2+12NO2-+能量CH3COOH+8NO3-→6H2O+10CO2+4N2+8OH—+能量反硝化作用使硝酸盐还原成氮气，从而降低了土壤中氮素营养的含量，对农业生产不利。农业上常进行中耕松土，使土壤与氧气充分接触以防止反硝化作用.反硝化作用是氮素循环中不可缺少的环节，可使土壤中因淋溶而流入河流、海洋中的NO3—减少，消除因硝酸积累对生物的毒害作用。所以我们应尽量发挥其有利的一面，为人类所利用。反硝化微生物对于硝酸根离子的还原步骤如右图，若要从微生物代谢角度验证菌株是否为反硝化菌最简单有效的方法便是测定nirS和nosZ基因是否存在.由于N2O和NO都是温室气体,是否含有nosZ基因对于菌种的用途有着实际且重要的意义，即可以使土壤中微生物代谢产生的N2O和NO还原成氮气[1]。本实验的目的便是通过筛选土壤中的反硝化菌，测定反硝化能力，鉴定其是否含有nirS和nosZ基因，对此进行综合分析，找出反硝化能力较强的菌株，最终制备纯培养的反硝化菌菌株。实验完成后,此菌株将有十分广大的应用前景。例如，将对农田等生态系统中其他微生物产生的N2O和NO等温室气体还原,减少温室气体的排放,为维持环境的稳定起到积极作用.实验材料与方法LB液体培养基（每1000ml)10g蛋白胨5g酵母提取物10gNaCl若加入15g琼脂粉则为LB固态培养基成分.TSA培养基：胰蛋白胨0。75g/L大豆胨0。25g/LNaCl0。25g/LGiltay培养基A溶液：KNO31。0g。天冬酰胺1.0g，1%BTB酒精溶液5mL，蒸馏水500mLB溶液：柠檬酸钠8.5g，MgSO4·7H2O1。0g,FeCl3·6H2O0。05g，KH2PO41。0g,CaCl2·2H2O0。2g，蒸馏水500mL混合A、B溶液，加入1%mol/L的NaOH溶液调节pH为7。1，灭菌备用。琼脂糖凝胶电泳全基因组电泳：TAEbuffer30ml琼脂糖0.8％(0。24g)PCR产物电泳：TAEbuffer50ml琼脂糖1.2%（0。6g）均加入荧光剂EB1微升Bead—Beater法所用试剂bufferZ:10mMTris—HCl,150mMNaCl,pH8.0（1。21gTris碱，8。755gNaCl,加HCl调至pH8.0,配成1L溶液）10％SDS(C12H25OSO3Na）100g溶于1L水pH5.3氯仿-异戊醇（24：1）苯酚(pH8.0）无水乙醇EirconiumbeadsScrewtubePCR反应体系(25μl）10×buffer2。5μlTaq酶0.25μlMgCl22μldNTP2μlprimer10。5μlprimer20。5μl水16。25μl模板1μlnosZnirSprimer1nosZFR3cdprimer2nosZRcd3aF修正PCR反应体系（50μL）10×buffer5μLTaq酶1μLdNTP7μLprimer11μLprimer21μL模板1～2μLDMSO1μLddH2O33μLPCR反应引物序列及条件目的基因引物引物序列(5’~3')反应条件nirS［2]cd3aFGTSAACGTSAAGGARACSGG94℃for2min,30×（94℃for30s,51℃for1min,72℃for1min),72℃for10minR3cdGASTTCG