谈慢性铝暴露对大鼠海马钙离子稳态及CaMKⅡ和CREB 活性的影响论文.docx

谈慢性铝暴露对大鼠海马钙离子稳态及CaMKⅡ和CREB活性的影响论文1材料与方法1.1主要材料选择60只断乳后Wistar大鼠(体重约30g)，由中国医科大学实验动物中心提供。CREB抗体、磷酸化(p)-CREB抗体(CellSignal公司);CaMKⅡ抗体、p-CaMKⅡ抗体、神经颗粒素(Ng)抗体(美国SANTACruz公司)、β肌动蛋白(β-actin)抗体、辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗(北京中杉生物公司);ECL发光试剂(美国Sigma公司)、Chemilmager5500V2103(美国)。其他试剂均为分析纯。1.2动物模型建立将60只(AlCl3)大鼠随机分3组，每组20只。对照组用蒸馏水喂养，Al暴露组分别用含有0.2%和0.4%氯化铝的蒸馏水喂养。动物室温度保持在18℃～23℃、相对湿度为45%～55%，光照时间12h∶12h。Al暴露大鼠保持健康，体重为对照大鼠的(90±6)%。3个月后，进行大鼠学习记忆的行为学及其他生化指标测定。1.3Morris水迷宫测定大鼠学习记忆行为参考文献的方法，Morris水迷宫测试在内径180cm、高60cm的圆形水池中进行。水深48cm，水温为(22±0.5)℃，水池内放入奶粉使之成为乳白色。将水池分为西南、西北、东南和东北(SW、NW、SE和NE)四个象限，NW象限正中距池壁20cm处放置逃避平台(直径约8cm)，平台位于水下2cm。水池正上方安装带有显示系统的摄像机，计算机自动跟踪计时并记录游泳轨迹，实验期内迷宫外参照物保持不变。Morris水迷宫实验包括定位航行实验和空间探索实验两个部分，根据相关文献，简单地说，实验大鼠每天游泳4次，分别从不同象限将动物头朝池壁入水，并在水池上标定相同一点作为每次实验大鼠的入水点，寻找平台时间上限设置为120s。如果在规定时间内未找到平台，由实验者将其引导至平台并停留30s以加强记忆，缓解紧张情绪。逃避潜伏期记录为120s，每只大鼠的游泳时间间隔为15min。观察和记录120s内大鼠穿越平台的次数、在原平台象限搜索时间占总时间的百分比和在原平台象限搜索距离占总距离的百分比，并记录大鼠在120s内搜索平台的路线图。空间探索实验只进行1次。1.4脑组织和血液中Al含量测定根据文献，准确分离并称取各组大鼠海马组织(约0.1～0.5g)或准确吸取0.2～0.5ml的全血于石英烧杯中，放入聚四氟乙烯(PTFE)中，加入5～8ml混酸(硝酸∶高氯酸体积比为4∶1)，同时做空白对照。低温加热至试样全部溶解，继续加热蒸发至近干后加0.2%硝酸溶解残留物，并以0.2%硝酸定容至50ml，采用石墨炉原子吸收分光光度法测定脑铝或血铝含量。1.5大鼠海马神经细胞内Ca2+含量测定〔20〕冰上分离大鼠海马组织后，放入D-Hank液中。37℃下用0.125%胰酶消化20min，反复吹打后离心，制备密度为106～107个/ml的单细胞悬液。台盼蓝染色，确定分离出的单细胞存活率在95%以上。将终浓度为4μmol/L的Fura-2/AM加入上述分离出来的细胞悬液中，37℃下孵育35min后，用含0.2%BSA的Hank液清洗残留的Fura-2/AM。然后，将细胞重悬于无Mg2+的Hank液中(mmol/L):HEPES10，KCl5.0，NaCl145，CaCl21.3，L-glucose10，Na2HPO4。采用日立F-3000型荧光双波长分光光度计测定细胞Ca2+浓度。激发光波长设定为340～380nm，发射光波长为510nm。根据下面公式计算Ca2+浓度〔Ca2+〕i=Kd〔(R-Rmin)/(Rmax-R)〕(Fmin/Fmax)。Kd值为224nmol/L，R为荧光值，〔Ca2+〕i为nmol/L，而Fmin为加入EGTA后测得的荧光值，Fmax为加入TritonX-100后测得的'荧光值。1.6逆转录实时PCR法检测mRNA表达冰上分离各组大鼠海马组织，按照TRIzol说明书(Invitrogen，USA)抽提各组海马组织的总RNA。应用紫外分光光度仪测定RNA样品260/280nm波长处吸光度比值为1.9～2.0。根据试剂盒说明书要求，采用oligo(dT)和superscriptⅡ进行逆转录后，用双标记荧光探针混合物(SYBRGreenPCRMastermix)在ABIprism7500自动序列分析系统(Biosystems)中进行实时定量PCR分析，每组重复3次。CaMKⅡ基因引物特异序列分别为5'-AGCCATCCTCACCACTAT-3'(上游)和5'-CTTCACGCCATCATTCTTC-3'(下游);CREB基因引物特异序列分别为:5'-CCAGCCATCAGTTATTCAGT-3'(上游)和5'-TTACACTATCCACAGACT