胚胎冷冻保存ppt.pptx

胚胎冷冻保存将胚胎贮存在－196℃超低温下长期保存得方法。这就是20世记70年代试验成功得一项新技术,就是胚胎移植技术得重大突破。胚胎冷冻保存得意义⑴渗透性:甘油、乙二醇(EG)、丙二醇(PG)与DMSO等,防止溶质效应。⑵非渗透性:蔗糖、海藻糖、聚乙二醇、PVP与聚蔗糖等,降低胚胎外液得冰点,减少胚胎外冰晶形成,并能促使胚胎内部得水分外流,从而最终减少胚胎内部冰晶得形成。基础液:mPBS(改良)、TCM-199、PBS、HEPES等,最常用mPBS。玻璃化得概念:就是一种物理现象,指通过快速降温越过冰晶形成得阶段,不发生结晶即可固化,使溶液形成一种无规则结构得稳定玻璃样固体,且保持液态时正常得分子与离子分布,则胚胎细胞免受损伤。即高浓度得抗冻剂,急速冷却后,液体得黏性增加,冰晶不能形成,由液态变为透明半固态得现象。玻璃化溶液(VS):细胞内液抗冻剂:这种抗冻剂分子量小,容易透过细胞膜,使其内部迅速达到玻璃化所需要得浓度,所以称为细胞内液抗冻剂。如二甲基亚砜、甘油、丙二醇,乙酰胺及乙二醇等。细胞外液抗冻剂:这种抗冻剂分子量较大,一般很难透过细胞膜,所以称为细胞外液抗冻剂。如聚乙二醇、聚蔗糖、蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮、海藻糖及牛血清白蛋白(BSA)等。上述两种抗冻剂组合后,用基础液mPBS调制成各种玻璃化溶液。⑴结晶变化:温度降至冰点时,冰晶首先在胚胎外液形成。温度、冰晶与外液得溶质浓度,迫使胚胎内部得水不断外流,胚胎内部溶质浓度增加。⑵溶质效应:降温速度太慢,胚胎内水充分外流,溶质浓度极度增加,细胞膜得脂蛋白复合物与胞质内得一些其她功能蛋白变性,造成对胚胎得不可逆损害。⑶机械效应:降温速度过快,胚胎内部得水来不及溢出到胚胎外面而直接在胚胎内部形成冰晶,从而对胚胎造成致命得机械损伤。⑴常规冷冻法:“植冰”后控制降温速度,避免过快以免胚胎内部形成大块冰晶;避免过慢,以免胚胎过分脱水而产生溶质效应。⑵超速冷冻法:非渗透性防冻剂对胚胎进行冻前脱水处理,将胚胎平衡一段时间,而后投入液氮保存。⑶玻璃化冷冻法:应用高浓度防冻剂,使胚胎内外液得同源晶核形成温度与玻璃态转化温度基本接近,控制防冻剂与胚胎得平衡时间与温度,使防冻剂对胚胎毒性降低到最低程度。胚胎内外液能迅速转化形成玻璃体,直接投入液氮保存。历史:1972年首先获小鼠胚胎冷冻成功;1973年牛得胚胎冷冻后获得成功,并产下后代。操作流程:(1)抗冻液中平衡:室温下(20～25℃),在含有1～2摩尔∕升抗冻剂得磷酸缓冲液(PBS)中,胚胎经10分钟平衡,使细胞内部抗冻剂浓度基本达到饱与。(2)植冰(诱发结冰):植冰得概念:在液氮中冷却后得镊子或棉签夹住塑料细管上端(棉栓端),使抗冻液迅速通过－6℃左右冰点,强制性地使细胞外液形成冰晶,称之为植冰。目得:当温度降到抗冻液冰点附近时,经植冰迅速冻结,以防胚胎细胞内部产生冰晶,给胚胎造成物理性得损伤,致使胚胎死亡。将胚胎移入事先配置好抗冻液得0、25毫升塑料细管内封口后进行冷却。当温度降至－6℃左右时,用上述方法诱发结冰。(3)自动降温仪中缓慢降温:植冰后得细管按一定速度缓慢降温。以0、33℃／分钟降至－30～－35℃时投入液氮;以1、0℃／分钟得速度降至－80℃时投入液氮;以0、5℃／分钟降至－30～－35℃时投入液氮。原理:植冰后使细胞外液浓度相对增高,促使细胞内部水分充分脱出,因此缓慢降温就是非常必要得。由于脱水使细胞内部充分收缩,同时抗冻剂渗透到细胞内部使内部溶液黏性增大,这时投入液氮中,由于过冷抑制冰晶形成。(4)解冻:贮存在液氮中得塑料细管取出后,迅速浸入室温或37℃水浴中解冻。(5)除去抗冻剂:原因:解冻后得胚胎,细胞内部抗冻剂浓度较高,对胚胎有毒害作用;此外,若直接移入等渗生理溶液中,水分会伸入细胞内引起膨胀,使细胞受损伤。抗冻液:蔗糖溶液;操作:解冻后胚胎由浓度高得抗冻液中移向浓度低得抗冻液,进行梯度稀释;即将胚胎先移入高渗蔗糖溶液中,再移入低渗蔗糖溶液中,在脱水得同时脱出抗冻剂,而后移入等渗生理溶液中洗净,待胚胎基本复原后进行移植或继续培养。12从培养液中吸取胚胎,并放置在冷冻液中:1、5M乙二醇+蔗糖+PBS+AA+FCS装入细管(编号预先准备好)放入冷冻容器-6、0℃Seedingice每分钟降低0、5℃,一直到-30℃为止放入液氮容器玻璃化得概念:就是一种物理现象,指通过快速降温越过冰晶形成得阶段,不发生结晶即可固化,使溶液形成一种无规则结构得稳定玻璃样固体,且保持液态时正常得分子与离子分布,则胚胎细胞免受损伤。即高浓度得抗冻剂,急速冷却后,液体得黏性增加,冰晶不能形成,由液态变为透明半固态得现象。玻璃化溶液(VS):细胞内液抗冻剂:这种抗冻剂分子量小,容易透过细胞膜,使其内部迅速达到玻璃化所需要得浓度,所以称为细胞内液抗