流式细胞术FlowCytometryFCM0.pptx

流式细胞术（FlowCytometry,FCM)1、流式细胞仪(FlowCytometer):是集光电子物理，光电测量，计算机，细胞荧光化学，单抗技术为一体的高科技细胞分析仪。2、流式细胞术(FlowCytometry):利用流式细胞仪对处于快速流动的细胞或生物颗粒进行多参数、快速（每秒可达1000-10000个）的定量分析和分选（纯度可达99%以上）的技术。流式细胞仪结构流式免疫分型技术要点FCM的主要测定指标FCM标记方法荧光素种类PE最强，适用于弱表达抗原FITC最便宜，适用于强表达抗原，适用范围广biotin-avidin不适合弱抗原的检测数据显示方式流式常见图形(HistogramPlot)流式细胞的主要信息:Fluorescence流式常见图形(HistogramPlot)流式常见图形(DotPlot)第二节流式细胞术的科研应用流式应用常见范围抗体标记的方法抗体的选择实验对照的设计空白对照和阴性对照的比较：实验标本的处理流式检测应用实例凋亡检测-每一步都有检测试剂盒细胞周期细胞周期不能区分凋亡与死亡细胞Sub-G0/G1peaks---PIstainingCaspasesAnnexinVAssay建议用于悬浮细胞AnnexinVAssay能够区分死亡与凋亡流式“TUNEL”IntracellularCytokine-ProtocolSORTING（细胞分选）DIMERXantigenspecificTcellassaymethodformonitoringcellularresponseCBA(CytometricBeadArray)TraditionalAnalysis--PercentpositiveDeterminationoftheCD4PEABConlymphocytes第三节流式细胞术的临床应用流式细胞白血病免疫分型流式细胞的免疫分型FCM应用细胞增殖周期测定和DNA倍体分析2）利用DNA的荧光染料，如PI（Propidiumiodide碘化丙啶），与细胞内的DNA结合，可反映细胞内DNA含量。采用DNA直方图显示。具有2CDNA含量细胞为G0/G1期细胞，4CDNA含量细胞为G2/M期细胞，DNA含量介于两者之间的细胞为S期细胞。3）DNA倍体：主要比较G0/G1期细胞DNA含量的变化。用DNA指数（DI）表示。DNA指数=测量样本G0/G1期DNA含量/正常人淋巴细胞G0/G1期DNA含量以正常人淋巴细胞作为对照。正常细胞DNA指数为1.00，DNA指数＞1，为超2倍体，＜1为亚2倍体，两者可统称为非整倍体。非整倍体细胞中肿瘤的特异性标志，实体肿瘤中出现频率较高。第四节凋亡检测2）DNA链损伤“TUNEL”法3）Annexin-V-FITC/PI双染法4）线粒体细胞膜电位的检测5）凋亡相关基因的检测——免疫标记法检测基因第五节免疫功能的检测第六节FCM在血液学中的应用2）CD34+造血干/祖细胞的检测。主要用于干细胞移植及基因治疗方面的检测。3）活化血小板及网织血小板的检测，在栓塞性疾病，如脑血管和心肌梗塞的患者，可出现活化的血小板增多。而血小板减少的患者，如果出现网织血小板增多，则说明血小板减少的原因为血小板破坏过多所致。4）阵发性睡眠性血红蛋白尿症（PNH）的发病机制为X染色体上的PIG-A基因发生突变，引起糖化肌醇脂（GPI）锚合成障碍，使GPI锚连蛋白缺乏，已证实的GPI锚连蛋白有10余种，用于PNH诊断的主要为CD55和CD59两种，如果在红细胞或WBC上出现CD55或/和CD59的减少，可诊断为PNH。5）网织红细胞计数6）白细胞分类计数第七节其他应用第八节细胞分选淋巴20-25%:T:70%,B:20%,NK:10%;单核2-6%+粒细胞:40-60%有核红:20-25%是白细胞（包括血小板、血管内皮细胞等）在正常分化成熟的不同阶段以及活化过程中在这些不同谱系（lineage）细胞胞浆或细胞膜表面出现或消失的标记，参与机体重要的生理和病理过程。八十年代在WHO和国际免疫学联合会(IUIS)组织下，将识别同一分化抗原的来自不同实验室的单克隆抗体归为一个分化群CD:clusterofdifferentiation/clusterdesignation1.系列交叉(cross-lineage):AML表达CD2,CD192.表达不同步(asynchronous):早期与晚期抗原同时表达3.表达量异常(over-orunder-expression):4.与细胞大小不匹配(abnormallightscatterprofile):如大CD2+细胞或小CD13+细胞鉴别淋髓系列区分亚型双表型、杂合型Mo、M7、AUL提示细胞遗传学异常部分与预后相关MDR监测GatingFCM设门法